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食品微生物檢驗GB4789.3-2016大腸菌群計數(shù)及注意事項

發(fā)布時間：2020-08-28      瀏覽次數(shù)：24155    分享：

一、大腸菌群定義和衛(wèi)生學(xué)意義

大腸菌群定義：在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。大腸菌群不是細菌學(xué)上分類命名，它不代表某一種或某一屬的細菌，而是一組與糞便污染有關(guān)的細菌。這群細菌包括：埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、產(chǎn)氣克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬（又叫產(chǎn)氣桿菌屬，包括陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌）和等。

衛(wèi)生學(xué)意義：大腸菌群作為糞便污染的指標菌評價樣品中是否受到糞便的污染。表示了對人體健康是否具有潛在的危險性。直接反映了樣品受糞便污染的的程度。


二、GB4789.3-2016大腸菌群MPN法

1.  什么是MPN法？

?MPN法是統(tǒng)計學(xué)和微生物學(xué)結(jié)合的一種定量檢測法。待測樣品經(jīng)系列稀釋并培養(yǎng)后,根據(jù)其未生長的最低稀釋度與生長的最高稀釋度,應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數(shù)。

?MPN值并不能表示實際菌落數(shù)， 實際菌落數(shù)有可能落在置信區(qū)間內(nèi)的任何一點，MPN值是落在這個置信區(qū)間內(nèi)概率最大的一點。

?靈敏度較高，適用于污染菌落較少的樣品。

2. 大腸菌群MPN計數(shù)的檢驗操作


3. 培養(yǎng)基原理解析

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）

?月桂基硫酸鹽能抑制革蘭氏陽性菌生長，胰蛋白胨提供碳源和氮源滿足細菌生長的需求；氯化鈉可維持均衡的滲透壓；乳糖是大腸菌群可發(fā)酵的糖類；磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀是緩沖劑。

?36±1℃培養(yǎng)24h后若已產(chǎn)氣，則可停止培養(yǎng)。如果沒有觀察到有產(chǎn)氣的現(xiàn)象，則繼續(xù)培養(yǎng)至48±2h。

?如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯。

-                                         +

煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）

?膽鹽與煌綠均能抑制革蘭氏陽性菌生長。

?培養(yǎng)基配方當(dāng)中含有膽鹽，大腸菌群發(fā)酵乳糖所產(chǎn)的酸會與膽鹽發(fā)生反應(yīng)，形成膽酸沉淀。培養(yǎng)基可由原來的綠色變?yōu)辄S色。

陰性                                 陽性

4. 大腸菌群最大可能數(shù)（MPN）報告

?確證的大腸菌群BGLB陽性管數(shù)，檢索MPN表，報告每1g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值。

?當(dāng)實驗結(jié)果在MPN表中無法查找到MPN值時，如：陽性管數(shù)為122，123，232，233等時，建議增加稀釋度（可做4~5個稀釋度），使樣品最高稀釋度能達到陰性終點(如果污染程度不能判定，則多加一稀釋度），然后再遵循相關(guān)的規(guī)則進行查找，最終確定MPN值。

表:大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表

陽 性 管 數(shù)


MPN

95%可 信 限

陽 性 管 數(shù)


MPN

95%可 信 限

0.10

0.01

0.001

下 限

上 限

0.10

0.01

0.001

下 限

上 限

0

0

0

<3.0

—

9.5

2

2

0

21

4.5

42

0

0

1

3.0

0.15

9.6

2

2

1

28

8.7

94

0

1

0

3.0

0.15

11

2

2

2

35

8.7

94

0

1

1

6.1

1.2

18

2

3

0

29

8.7

94

0

2

0

6.2

1.2

18

2

3

1

36

8.7

94

0

3

0

9.4

3.6

38

3

0

0

23

4.6

94

1

0

0

3.6

0.17

18

3

0

1

38

8.7

110

1

0

1

7.2

1.3

18

3

0

2

64

17

180

1

0

2

11

3.6

38

3

1

0

43

9

180

1

1

0

7.4

1.3

20

3

1

1

75

17

200

1

1

1

11

3.6

38

3

1

2

120

37

420

1

2

0

11

3.6

42

3

1

3

160

40

420

1

2

1

15

4.5

42

3

2

0

93

18

420

1

3

0

16

4.5

42

3

2

1

150

37

420

2

0

0

9.2

1.4

38

3

2

2

210

40

430

2

0

1

14

3.6

42

3

2

3

290

90

1000

2

0

2

20

4.5

42

3

3

0

240

42

1000

2

1

0

15

3.7

42

3

3

1

460

90

2000

2

1

1

20

4.5

42

3

3

2

1100

180

4100

2

1

2

27

8.7

94

3

3

3

>1100

420

—

注1:本 表 采 用3個 稀 釋 度[0.1g(mL)、0.01g(mL)、0.001g(mL)],每 個 稀 釋 度 接 種3管 。

注2:表 內(nèi) 所 列 檢 樣 量 如 改 用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)時,表 內(nèi) 數(shù) 字 應(yīng) 相 應(yīng) 降 低10倍;如 改 用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)時,則 表 內(nèi) 數(shù) 字 應(yīng) 相 應(yīng) 增 高10倍,其 余 類 推 。

三、GB4789.3-2016大腸菌群計數(shù)平板法

1. 大腸菌群平板計數(shù)法流程圖

2. 培養(yǎng)基原理解析

結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）

?配方中膽鹽和結(jié)晶紫抑制革蘭氏陽性菌，中性紅作為指示劑，在酸性條件下為紫紅色。

?大腸菌群分解乳糖所產(chǎn)的酸與膽鹽結(jié)合，可形成粉紅色菌落菌落周圍有膽酸鹽沉淀環(huán)。

?該培養(yǎng)基無需高溫高壓滅菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。

大腸埃希氏菌ATCC25922在VRBA上的菌落形態(tài)

3. 計數(shù)典型和可疑菌落數(shù)

結(jié)果判讀：選取菌落數(shù)在15 CFU～150 CFU之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5 mm或更大。

證實試驗：從各樣品中接種同一樣品濃度的VRBA平板上共挑取10 個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)24 h～48 h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。

4. 大腸菌群平板計數(shù)的報告

?經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以計數(shù)的平板菌落數(shù),再乘以稀釋倍數(shù),即為每g(mL)樣品中大腸菌群數(shù)。例:10-4樣品稀釋液1mL,在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落,挑取其中10個接種BGLB肉湯管,證實有6個陽性管,則該樣品的大腸菌群數(shù)為:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。

?若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。

四、質(zhì)量控制

1. 實驗室過程中，每批樣品稀釋液都要做空白對照。 

2. 為了控制環(huán)境污染，每次檢驗過程中，于檢驗臺上打開兩塊計數(shù)瓊脂平板，并在檢驗環(huán)境中暴露不少于15分鐘，將此平板與本批次樣品同時進行培養(yǎng)，以掌握檢驗過程中是否存在來自檢驗環(huán)境的污染。 

3. 定期使用大腸埃希氏菌ATCC25922或相應(yīng)定量活菌參考品，在P2實驗室或陽性對照實驗室內(nèi)，用適當(dāng)?shù)氖称窐悠愤M行陽性實驗驗證，并進行記錄，次驗證實驗至少每2個月進行1次。

五、大腸菌群測試片法

1.  原理：大腸菌群檢測片由輕便防水紙質(zhì)材料做支撐，其上覆蓋干燥培養(yǎng)基層（營養(yǎng)物質(zhì)、凝固劑、選擇抑制劑、顯色劑）和透明隔水膜組成，經(jīng)輻照滅菌。可用于食品、飲料等的大腸菌群計數(shù)。含有四氮唑指示劑菌落為紅色，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸和產(chǎn)氣。

2. 特點優(yōu)勢

?菌落計數(shù)特別方便（容易判讀），紅色菌落，易于食品顆粒分開，無菌落重疊現(xiàn)象；

?菌落分布特別均勻；

?避免了培養(yǎng)基對細菌熱損傷有關(guān)；

?菌落蔓延或半透明菌膜現(xiàn)象很少發(fā)生

?經(jīng)濟環(huán)保 無粉塵，體積小，重量輕，易儲運 

?保質(zhì)期長干制無水培養(yǎng)基，性質(zhì)穩(wěn)定，保質(zhì)期更長

六、所需培養(yǎng)基試劑和質(zhì)控菌株

用途

貨號

名稱

規(guī)格

樣品稀釋

CP0630

生理鹽水

盒（袋裝）225 mL×10袋

CP0511A

磷酸鹽緩沖液（PBS）

盒（瓶裝）225 mL×6瓶

CP0640

磷酸鹽緩沖液（PBS）

盒（袋裝）225 mL×10袋

022117

磷酸鹽緩沖液（PBS）

瓶（干粉）250 g

CP0310

生理鹽水

盒（管裝）9 mL×20支

MPN法計數(shù)初發(fā)酵試驗

022210

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）

瓶（干粉）250g

022210P1

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST)

瓶（顆粒）250 g

022210A

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）

盒（管裝）10 mL×20支

22210G1

雙料月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯

盒（管裝）10 mL×20支

平板計數(shù)

022221

結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）

瓶（干粉）250g

022221P1

結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）

瓶（顆粒）250g

C22221B1

結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂平板

盒（平板）90 mm×20

MPN法復(fù)發(fā)酵和平板計數(shù)證實

022220

煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）

瓶（干粉）250g

022220P1

煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)

瓶（顆粒）250g

022220A

煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）

盒（管裝）10 mL×20支

HANDYPLAT微生物測試片

HP002

大腸菌群測試片

20片/包

Q-Strain定量質(zhì)控菌株

QS011A

大腸埃希氏（ATCC25922）

110-1100 CFU/瓶

QS011B

大腸埃希氏菌（ATCC25922）

(0.6-2.0)×107CFU/瓶


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