一、菌落總數(shù)定義和衛(wèi)生學(xué)意義

?菌落總數(shù)定義：指在一定條件下（如需氧情況、營養(yǎng)條件、pH、培養(yǎng)溫度和時間等）每克（每毫升）檢樣所生長出來的菌落數(shù)

?衛(wèi)生學(xué)意義：菌落總數(shù)測定是用來判定食品被細菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，它反映食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求，以便對被檢樣品做出適當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評價。菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣。

二、新標(biāo)準(zhǔn)概況

2022年06月30日發(fā)布     2022年12月30日實施

本標(biāo)準(zhǔn)與ＧＢ４７８９.２—２０１６相比，主要變化如下： —— 增加了附錄Ｂ(菌落總數(shù)結(jié)果不同情況計算方法示例)； —— 修改了設(shè)備和材料； —— 修改了培養(yǎng)基和試劑； —— 修改了檢驗程序； —— 修改了操作步驟； —— 修改了附錄 Ａ（pca配方標(biāo)注主要營養(yǎng)成分）。

三、修訂亮點

修訂亮點:“增加菌落總數(shù)測試片”

四、HandyPlate測試片的質(zhì)量控制

HandyPlate測試片質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)

?GB4789.28-2013 食品微生物學(xué)檢驗 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求

測試片使用步驟：
1、制備適宜濃度的測試菌液(可按GB4789.28自己制備，也可采用商品的定量菌株）

2、取1ml接種待測試測試菌片，另取1ml測試菌液傾注參比培養(yǎng)基TSA，按GB4789.28-2013附錄D中平板計數(shù)瓊脂（PCA）對應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)上的培養(yǎng)條件進行。

3、計數(shù)待測測試片上和參比培養(yǎng)基TSA上的菌落數(shù)（下圖為測試菌大腸埃希氏菌ATCC25922在菌落總數(shù)測試片和參比培養(yǎng)基上生長的結(jié)果）

選擇菌落數(shù)適中的平板進行計數(shù)，按下列式（1）計算生長率。

式中：
PR——生長率；
NS——待測培養(yǎng)基平板上得到的菌落總數(shù)；
N0——參比培養(yǎng)基平板上獲得的菌落總數(shù)。
參比培養(yǎng)基的選擇：一般細菌采用TSA，一般霉菌和酵母采用沙氏葡萄糖瓊脂，對營養(yǎng)有特殊要求的微生物采用適合其生長的不含抑菌劑或抗生素的培養(yǎng)基。
5、結(jié)果判定

依據(jù)GB4789.28-2013附錄D中平板計數(shù)瓊脂（PCA）對應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)上質(zhì)控評定標(biāo)準(zhǔn)各測試菌的生長率≥0.7，如測試的測試片各測試菌生長率≥0.7，則報告檢驗合格，否則，為不合格。

五、其他變更情況

其他一般修訂內(nèi)容：

六、操作流程及注意事項

菌落總數(shù)檢驗流程圖

操作注意事項
1：從樣品的均質(zhì)到傾注瓊脂，應(yīng)在盡快完成，避免影響結(jié)果；
2：檢驗所用物品需無菌和無殘留的抑菌物質(zhì)；
3：建議用磷酸鹽緩沖液作為稀釋液，因為磷酸鹽緩沖液能更好地糾正食品樣品中pH變化，對細菌具有保護作用；
4：高壓滅菌后，培養(yǎng)基的瓊脂會分層在底部，應(yīng)搖勻后使用；
5：在培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，為防止中間平皿過熱，高度不得超過6個平皿。測試片堆疊不超20片

七、結(jié)果計算

1. 結(jié)果計數(shù)

?可用肉眼觀察,必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器,記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落形成單位(colony-formingunits,CFU)表示。 

?選取菌落數(shù)在30CFU~300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù),大于300CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。

?其中一個平板有較大片狀菌落生長時,則不宜采用,而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù);若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻,即可計算半個平板后乘以2,代表一個平板菌落數(shù)。

?當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長勢，則將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。

2. 結(jié)果計算

?若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在30~300CFU之間,計算兩個平板菌落數(shù)的平均值,再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù),作為每g(mL)樣品中菌落總數(shù)結(jié)果，示例B1。

?若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU,則對稀釋度最高的平板進行計數(shù),其他平板可記錄為多不可計,結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算，示例B3。

?若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU,則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算，示例B4。

?若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算，示例B5。

?若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30CFU~300CFU 之間,其中一部分小于30CFU 或大于300CFU 時,則以最接近30CFU 或300CFU 的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算，示例B6。

?若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時,按式(1)計算，示例B2

表1  菌落總數(shù)結(jié)果計算與報告方式實例

3. 結(jié)果報告

?菌落數(shù)小于100CFU 時,按“四舍五入”原則修約,以整數(shù)報告。

?菌落數(shù)大于或等于100CFU 時,第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數(shù)字,后面用0代替位數(shù);也可用10的指數(shù)形式來表示,按“四舍五入”原則修約后,采用兩位有效數(shù)字。 

?若所有平板上為蔓延菌落而無法計數(shù),則報告菌落蔓延。（已刪除）

?若空白對照上有菌落生長,則此次檢測結(jié)果無效。

?稱重取樣以CFU/g為單位報告,體積取樣以CFU/mL為單位報告。

八、質(zhì)量控制和疑難解析

1. 樣品處理時是否需調(diào)節(jié)pH?

 答：菌落總數(shù)大部分細菌都是嗜中性的，在偏酸偏堿的環(huán)境中都不適宜生長，如果樣品本身偏酸或偏堿，那接種后會改變平板瓊脂培養(yǎng)基的pH，從而影響樣品中大多數(shù)微生物的生長，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2. 菌落蔓延怎么辦？

 答：首先需分析菌落蔓延的原因，一可能是樣品中含有運動性強的細菌如：變形桿菌、芽孢桿菌等，二可能是傾注時瓊脂培養(yǎng)基溫度高，形成較多冷凝水，三可能是培養(yǎng)時沒有倒置，冷凝水滴落所致。

解決辦法：一、注意傾注培養(yǎng)基溫度控制在40-45度之間，避免冷凝水形成；二、培養(yǎng)時需倒置；三覆蓋一層培養(yǎng)基；四在培養(yǎng)基中添加ttc0.5%，三 、使用菌落總數(shù)測試片。

3. 菌落總數(shù)計數(shù)同一個稀釋度一個在計數(shù)范圍，一個不在計數(shù)范圍，怎么計？

 答：以在計數(shù)范圍的平板菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)作為報告結(jié)果。例如：某樣品10-1平板菌落數(shù)分別320、288，10-2稀釋度平板菌落數(shù)26、20，則樣品檢測結(jié)果選取288進行報告，結(jié)果報告為2.9×10的3次方。

4. 平行兩個板結(jié)果相差較大？

 答：可能是樣液未完全混勻，導(dǎo)致菌落分布不均勻；或者取樣偏差較大，注意校準(zhǔn)取樣器具和取樣操作細節(jié)。平板間、稀釋度間菌落數(shù)誤差率不宜超10%。

5. 低稀釋度平板菌落數(shù)少于高稀釋度平板菌落數(shù)的原因是？

 答：一產(chǎn)品中含防腐劑或抑菌成分，二產(chǎn)品偏酸或偏堿。

6. 做菌落總數(shù)檢測時，沒有菌落是怎么回事？

 答：一可能是樣品經(jīng)過滅菌處理，本身就沒有菌；二是檢測選擇的稀釋度過高；三樣品含抑菌成分未做去干擾處理；四傾注培養(yǎng)基溫度高或者培養(yǎng)條件不適宜等等。

7. 菌落總數(shù)的單位CFU與個有什么區(qū)別？

 答：CFU是菌落形成單位，單不等于細菌個數(shù)，如兩個相同的細菌細胞連在一起，那經(jīng)過培養(yǎng)后這兩個細菌細胞將會形成一個菌落。

8. 如何保證檢測結(jié)果的有效性？

 答：一檢測過程需做空白對照，避免外源污染物影響；二檢驗用培養(yǎng)基使用前需進行質(zhì)量確認；三檢驗過程所用器具經(jīng)檢定，操作規(guī)范減少誤差。

Q-Strain定量質(zhì)控菌株

九、所需培養(yǎng)基試劑和質(zhì)控菌株

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