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食品微生物檢驗(yàn)GB4789.4-2016 沙門氏菌檢驗(yàn)及注意事項(xiàng)

發(fā)布時(shí)間:2020-09-21      瀏覽次數(shù):24319    分享:

一、沙門氏菌生物學(xué)特性

      生物學(xué)特性:沙門氏菌屬是食源性細(xì)菌性腸胃炎的首要病原菌,屬于腸桿菌科,革蘭氏陰性無芽孢桿菌,營養(yǎng)需求不高,需氧或兼性厭氧。典型菌株多具有周生鞭毛、能運(yùn)動(除雞瘟沙門菌和雞沙門菌外)、大部分菌株產(chǎn)H2S、能分解葡萄糖并產(chǎn)氣,最適培養(yǎng)溫度為37℃,最適pH 7.2~7.6。耐受膽鹽,在糞便、土壤、食品、水中可生存5個(gè)月至二年之久。

      血清型:沙門菌屬由兩個(gè)種組成:腸道沙門菌(S.enterica)和邦哥沙門氏菌(S.bongori)。目前已知沙門氏菌血清型有2500多種,

      流行學(xué)特征:引起食物中毒最常見的沙門氏菌包括鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌。而易引起沙門氏菌中毒的食品則有肉、蛋、乳類等。

二、沙門氏菌的檢驗(yàn)

三、養(yǎng)基原理解析

      1. 緩沖蛋白胨水(BPW)

      ?其成分中含有磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉,起緩沖液的作用;

      ?蛋白胨提供生長營養(yǎng),有利于損傷沙門氏菌的復(fù)蘇。

      2. 四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)

      ?配方中硫代硫酸鈉和碘經(jīng)氧化生成四硫磺酸鈉,它對大腸菌群有抑制作用,對沙門氏菌無影響(因沙門氏菌具有四硫磺酸酶,能分解四硫磺酸鈉,而大腸菌群沒有這種酶,故生長受抑制);

      ?碳酸鈣為緩沖劑,可使沙門氏菌不致因酸堿度改變面死亡。

      ?由于配方含碳酸鈣,因此,該培養(yǎng)基配置后的最終pH不在7.0±0.2,而是偏堿性。

四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)

      3. 亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)

      ?蛋白胨提供碳源和氮源滿足細(xì)菌生長的需求;乳糖是可發(fā)酵的糖類;亞硒酸氫鈉抑制革蘭氏陽性菌和非沙門氏菌的大多數(shù)革蘭氏陰性腸道菌;磷酸鹽是緩沖劑;L-胱氨酸為還原劑。

      ?使用過程中要注意SC培養(yǎng)基不穩(wěn)定,配置時(shí)避免過度加熱。

亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)

      4. 亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基(BS)

      ?配方中亞硫酸鈉可與檸檬酸鉍銨生成亞硫酸鉍,抑制革蘭氏陽性菌和大腸菌群;硫酸亞鐵可產(chǎn)生硫化氫,并與鐵反應(yīng)生成黑色沉淀。

      ?沙門氏菌在BS上的典型菌落特征:具有金屬光澤的棕色或黑色菌落。但有些菌株形成非典型菌落特征:灰綠色的菌落,周圍培養(yǎng)基不變。

      ?BS平板應(yīng)制備后避光常溫保存,并在24h內(nèi)使用。

亞硫酸鉍瓊脂(BS)菌落特征

      5. HE瓊脂培養(yǎng)基

      ?配方中膽鹽、去氧膽酸鈉、溴麝香草酚蘭等成分可抑制革蘭氏陽性菌生長;酸性復(fù)紅作為酸堿指示劑的同時(shí),也可抑制陽性菌,但對陰性腸道菌無抑制作用,選擇性較弱。硫代硫酸鈉可被細(xì)菌還原產(chǎn)生硫化氫,與檸檬酸鐵銨反應(yīng)生成黑色硫化亞鐵。

      ?菌落特征:藍(lán)綠色或藍(lán)色,多數(shù)菌落中心黑色或全幾乎全黑色;有些菌株為黃色,中心黑色或幾乎全黑色。

HE瓊脂菌落特征——鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028

      6. XLD瓊脂培養(yǎng)基

      ?配方中木糖、乳糖和蔗糖成分作為可發(fā)酵的碳源,除志賀氏菌外,其他大多數(shù)腸桿菌均能發(fā)酵木糖;沙門氏菌發(fā)酵木糖產(chǎn)酸,形成酸性環(huán)境有利于產(chǎn)生脫羧酶使賴氨酸脫羧,從而使培養(yǎng)基的pH值升高向堿性轉(zhuǎn)變;在堿性條件下,硫代硫酸鈉及檸  檬酸鐵銨成分與沙門氏菌產(chǎn)生的硫化氫反應(yīng)是的菌落的顏色呈黑色;去氧膽酸鹽成分可抑制革蘭氏陽性菌的生長。

      ?菌落特征:菌落呈粉紅色,帶或不帶黑色中心,有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心,或呈現(xiàn)全部黑色的菌落;有些菌株為黃色菌落,帶或不帶黑色中心。

XLD瓊脂菌落特征——鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028

       7. 沙門氏菌顯色培養(yǎng)基

      ?蛋白胨和酵母膏粉提供碳氮源和微量元素;氯化鈉可維持均衡的滲透壓;瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑;膽鹽抑制革蘭氏陽性菌;選擇性添加劑增強(qiáng)培養(yǎng)基的抑制雜菌的能力;混合色素分別與沙門氏菌和大腸菌群所對應(yīng)的酶發(fā)生特異性反應(yīng),水解底物,釋放出顯色基團(tuán),在淡黃色平板上沙門氏菌產(chǎn)生品紅色的菌落,大腸菌群產(chǎn)生藍(lán)綠色的菌落。

CRM004 沙門顯色培養(yǎng)基——鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028

      8. 三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基

      ?蛋白胨、牛肉膏粉提供氮源、維生素、礦物質(zhì);乳糖、葡萄糖、蔗糖為可發(fā)酵糖類,其產(chǎn)酸時(shí)通過酚紅指示劑測出,酸性呈黃色,堿性呈紅色;硫代硫酸鈉可被某些細(xì)菌還原為硫化氫,與硫酸亞鐵銨中的鐵鹽生成黑色硫化鐵;氯化鈉維持均衡的滲透壓;瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。

三鐵塘

      9. 賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基

      ?具有氨基酸脫羧酶的細(xì)菌,能分解氨基酸使其脫羧生成胺(賴氨酸→尸胺)和二氧化碳,使培養(yǎng)基變堿,使指示劑顯示出來。

      ?結(jié)果判讀:陽性為試驗(yàn)管為綠色-藍(lán)綠色,對照管變黃色; 陰性為試驗(yàn)管和對照管均變黃色,或均不變色。

賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽性

      10. 靛基質(zhì)試驗(yàn)

      ?某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合,形成玫瑰吲哚,為紅色化合物。

      ?結(jié)果判讀:陽性為滴加靛基質(zhì)試劑后液面立即變玫紅色;陰性為滴加試劑后不變紅色。

靛基質(zhì)試驗(yàn)

      11. 尿素酶試驗(yàn)

      ?具有尿素酶的細(xì)菌分解培養(yǎng)基中的尿素,產(chǎn)生大量的氨,使培養(yǎng)呈堿性,酚紅指示劑在pH6.8時(shí)呈黃色,pH8.1呈粉紅色。

      ?結(jié)果判讀:陽性為玫紅色; 陰性為淡橙紅色-淡黃色。

尿素酶試驗(yàn)

      12. 氰化鉀利用試驗(yàn)

      ?氰化鉀是細(xì)菌呼吸酶系統(tǒng)的抑制劑,可與呼吸酶作用使酶失去活性,抑制細(xì)菌的生長,但有的細(xì)菌在一定濃度的氰化鉀存在時(shí)仍能生長,以此鑒別細(xì)菌.。

      ?結(jié)果判讀:陽性為試驗(yàn)管和對照管都有生長變渾濁; 陰性為試驗(yàn)管澄清不見生長,對照管生長渾濁。

氰化鉀利用陰性結(jié)果

      13. 糖(醇)發(fā)酵試驗(yàn)

      ?絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖(醇)類作為碳源和能源,但是它們在分解糖(醇)的能力上有很大的差異,有些細(xì)菌能分解某種糖(醇)并產(chǎn)酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和氣體(如氫、甲烷、二氧化碳等);有些細(xì)菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。酸的產(chǎn)生可利用指示劑來斷定。

      ?(指示劑為溴甲酚紫)結(jié)果判讀:陽性為變黃色;陰性為紫色。

甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)

      14. 沙門氏菌屬不同生化反應(yīng)結(jié)果出現(xiàn)百分率

實(shí)驗(yàn)名稱

反應(yīng)結(jié)果

沙門菌比例(%)

三糖鐵發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸

陽性

100

三糖鐵發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣

陽性

91.93

三糖鐵發(fā)酵乳糖

陰性

99.24

三糖鐵發(fā)酵蔗糖

陰性

99.5

三糖鐵產(chǎn)硫化氫

陽性

91.6

尿素(pH7.2)

陰性

99

賴氨酸脫羧酶

陽性

94.65

ONPG

陰性

98.44

VP

陰性

100

靛基質(zhì)試驗(yàn)

陰性

98.9

      15. 沙門氏菌判定表

三糖鐵

賴氨酸脫羧酶

靛基質(zhì)

尿素(pH7.2)

補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)

O與H多價(jià)

結(jié)果判定

斜面

底層

硫化氫

紅色

黃色

產(chǎn)

陽性

陰性

陰性

無需補(bǔ)充

均凝集

沙門氏菌屬

紅色

黃色

不產(chǎn)

陽性

陰性

陰性

ONPG陰性

均凝集

沙門氏菌屬

黃色

黃色

產(chǎn)

陽性

陰性

陰性

無需補(bǔ)充

均凝集

沙門氏菌屬

黃色

黃色

不產(chǎn)

陰性

無需測試

無需測試

無需補(bǔ)充

無需測試

非沙門氏菌

紅色

紅色

產(chǎn)/不產(chǎn)

陽性/陰性

無需測試

無需測試

無需補(bǔ)充

無需測試

非沙門氏菌

?在接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基的同時(shí),可直接接種蛋白胨水(供做靛基質(zhì)試驗(yàn))、尿素瓊脂(pH7.2)、氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基,一定要注意是同一個(gè)菌落,這種實(shí)驗(yàn)組合的優(yōu)勢是可篩選掉更多的非沙門氏菌,減少后續(xù)工作量。

?上述結(jié)果判定僅適用于典型沙門氏菌,如出現(xiàn)非典型結(jié)果,應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定和血清學(xué)分型進(jìn)行確認(rèn)。

      16. 071740 沙門氏菌生化鑒定盒(接種鼠傷寒沙門氏菌的結(jié)果)

       17. EasyID 沙門氏菌生化鑒定盒(接種鼠傷寒沙門氏菌的結(jié)果)

四、血清試驗(yàn)

      血清學(xué)鑒定中的多價(jià)菌體(O)和多價(jià)鞭毛抗原鑒定是沙門氏菌鑒定的必做項(xiàng)目,血清學(xué)分型為選作試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室必須配備沙門氏菌的多價(jià)菌體(O)和多價(jià)鞭毛(H)診斷血清。血清學(xué)試驗(yàn)必須基于生化結(jié)果試驗(yàn)的結(jié)果,不能單純以血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來報(bào)告最終。

A-F “O”多價(jià)血清凝集                     A-F “O”多價(jià)血清不凝集

五、沙門氏菌恒溫?zé)晒夂怂峥焖贆z測

六、沙門氏菌檢驗(yàn)所需培養(yǎng)基試劑

用途

貨號

名稱

規(guī)格

前增菌

023130

緩沖蛋白胨水(BPW)

  瓶(干粉)250g

CP0680

緩沖蛋白胨水(BPW)

  盒(袋裝)225 mL×10袋

CP0290

緩沖蛋白胨水(BPW)

  盒(瓶裝)225 mL×6瓶

CP0560A

緩沖蛋白胨水(BPW)

  盒(管裝)9 mL×20支

023130P1

緩沖蛋白胨水(BPW)

  瓶(顆粒)250 g

二次增菌

023030

四硫磺酸鈉煌綠增菌液基礎(chǔ)(TTB)

  瓶(干粉)250g

SR0040

四硫磺酸鈉煌綠增菌液配套試劑

  盒(西林瓶)2×5支/盒

CP0300

四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)

  盒(管裝)10 mL×20支

023040

亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)

  瓶(干粉)250g

CP0050

亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)

  盒(管裝)10 mL×20支

023040P1

亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)

  瓶(干粉)250g

平板分離

023052

亞硫酸鉍瓊脂(BS)

  瓶(干粉)250g

023070

HE瓊脂培養(yǎng)基

  瓶(干粉)250g

CP0110

HE瓊脂培養(yǎng)基

  盒(平板)90 mm×20

029999

木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽瓊脂(XLD

 瓶(干粉)250g

029999P1

木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽瓊脂(XLD)

 瓶(顆粒)250 g

CP0180

木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽瓊脂(XLD)

 盒(平板)90 mm×20

CRM004

沙門氏菌顯色培養(yǎng)基

 1000 mL

CP0560

沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板

 盒(平板)90 mm×20

生化鑒定

022080

三糖鐵瓊脂(TSI)

 瓶(干粉)250g

CP0080

三糖鐵斜面

 盒(管裝)20支

022110

蛋白胨水

 瓶(干粉)100g

075240

蛋白胨水

 盒(西林瓶)20支

029230

靛基質(zhì)試劑

 10 mL×1支/盒

023090

尿素瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ)

 瓶(干粉)100g

029100

40%無菌尿素溶液

 盒(西林瓶)2 mL×10支

075150

尿素(凍干)

 10支(凍干)+10支(無菌水)

075330

氰化鉀生長實(shí)驗(yàn)管

 盒(西林瓶)20支

075340

氰化鉀對照管

 盒(西林瓶)20支

生化鑒定

075280

賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基

 盒(西林瓶)20支

075290

氨基酸脫羧酶對照培養(yǎng)基

 盒(西林瓶)20支

029110

無菌石蠟油

10 mL×1支

075090

山梨醇

 盒(西林瓶)20支

075040

甘露醇

 盒(西林瓶)20支

075180

β-半乳糖苷ONPG

 盒(西林瓶)20支

075100

衛(wèi)矛醇

 盒(西林瓶)20支

075140

水楊素(水楊苷)

 盒(西林瓶)20支

075190

丙二酸鹽

 盒(西林瓶)20支

HKI 02

Easy ID沙門氏菌生化鑒定盒(不含三糖鐵)

血清學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)

HM42

沙門氏菌乳膠凝集試劑盒

 50 tests

026050

半固體瓊脂

 瓶(干粉)250g

075350A

半固體瓊脂

 盒(管裝)20支

023118

沙門氏菌鞭毛誘導(dǎo)軟瓊脂

 瓶(干粉)250g

核酸快速檢測試劑盒

KJD05L

沙門氏菌核酸檢測試劑盒(恒溫?zé)晒夥?

 24測試/盒

HANDY PALTE微生物測試片

HP005

沙門氏菌檢測片

 20片/包



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