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黃曲霉毒素具有較強(qiáng)的毒害作用，可誘發(fā)肝、腎、肺、胃等部位的癌變，黃曲霉毒素B1被公認(rèn)為是目前致癌力最強(qiáng)的天然物質(zhì)。
藥材、飲片及制劑在貯藏、制備、運(yùn)輸過程中，如保存不當(dāng)，就會(huì)有受潮霉變而污染黃曲霉毒素的可能。
因此，各藥典都將黃曲霉毒素列為很重要的安全性指標(biāo)，中國(guó)藥典和歐洲藥典對(duì)多種中藥材都都建立了黃曲霉素檢查指標(biāo)，美國(guó)藥典對(duì)植源性的藥品也要求檢查黃曲霉毒素。
今天小編就詳細(xì)介紹中國(guó)藥典、歐洲藥典和美國(guó)藥典的黃曲霉毒素測(cè)定方法，總結(jié)出各藥典的差異，并列出詳細(xì)的檢驗(yàn)方法，供各位參考。
1、比較中國(guó)藥典、美國(guó)藥典、歐洲藥典的檢查方法
各藥典中方法號(hào)、限度、適用范圍等列表如下，由此可見，各藥典收載的檢測(cè)方法不同、限度不同，最嚴(yán)格的當(dāng)屬歐洲藥典。
| 對(duì)比內(nèi)容 | 中國(guó)藥典 | 美國(guó)藥典 | 歐洲藥典 | |
|---|---|---|---|---|
| 依據(jù) | 通則2351真菌毒素測(cè)定法 | GENERAL CHAPTERS<561> | 2.8.18 DETERMINATION OF AFLATOXIN B1 IN HERBAL DRUGS | |
| 方法 | 第 一 法 | HPLC法 | TLC法 | HPLC法 |
| 第 二 法 | HPLC-MS法 | 薄層掃描法 | ||
| 第 三 法 | 酶聯(lián)免疫法 | HPLC法 | ||
| 限度 | 每1000g含黃曲霉毒素B1不得過5μg ，總量不得過 10μg。 | 每1000g含黃曲霉毒素B1不得過5μg，總量不得過 20μg。 | 每1000g含黃曲霉毒素B1不得過2μg，總量不得過4μg。 | |
| 說明 | 中國(guó)藥典的三種方法都可以使用，當(dāng)測(cè)定結(jié)果超出限度時(shí)，采用第二法進(jìn)行確認(rèn)。 | 首先使用第一法，第一法系統(tǒng)適用性不通過才會(huì)使用第二法或第三法。 | 只有一種方法，適用于devil' s claw root, ginger and senna pods，用于其他品種需要驗(yàn)證適用性。 | |
注：總量為黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）和黃曲霉毒素G2（AFG2）的總量。
2、詳解中國(guó)藥典、美國(guó)藥典、歐洲藥典的HPLC方法
黃曲霉毒素檢查方法中，唯一同時(shí)適用于三家藥典的方法，只有HPLC法（熒光檢測(cè)器），而且光化學(xué)檢測(cè)器與HPLC-熒光檢測(cè)器配套使用，在線對(duì)黃曲霉毒素B1、G1進(jìn)行衍生，不需要任何化學(xué)試劑，應(yīng)用范圍較廣，因此本文重點(diǎn)比較此法在各藥典中的異同。
從以下幾部分可以看出，色譜柱、流動(dòng)相、流速、波長(zhǎng)、供試品和對(duì)照品的配制方法、進(jìn)樣量等內(nèi)容都存在較大差異，需要謹(jǐn)慎對(duì)照使用。
本文詳細(xì)寫出了USP中的幾種測(cè)定方法。
2.1 中國(guó)藥典中黃曲霉毒素檢查方法（HPLC法）
| 檢驗(yàn)方法 | 具體內(nèi)容 |
|---|---|
| 色譜柱 | 十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑 |
| 流動(dòng)相 | 甲醇-乙腈-水(40 : 18 : 42) |
| 流速 | 1.0mL/min |
| 柱后衍生化 | 光化學(xué)衍生器（254nm） |
| 檢測(cè)器 | 熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)360nm (或365nm)，發(fā)射波長(zhǎng)450nm。 |
| 系統(tǒng)適用性 | 兩個(gè)相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5；需確認(rèn)回收率應(yīng)在60~120%，線性回歸的相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.990； |
| 混合對(duì)照品溶液 | 精密量取黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液（黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2 標(biāo)示濃度分別為 1.0μ/mL、0. 3μg/mL、1.0μg/mL、0.3μg/mL）0.5mL，置10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為貯備溶液。精密量取貯備溶液1mL，置25mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。 |
| 供試品溶液 | 取供試品粉末約15g（過二號(hào)篩），精密稱定，置于均質(zhì)瓶中，加入氯化鈉3g，精密加入70%甲醇溶液75mL, 高速攪拌2 分鐘（攪拌速度大于11000 r/min），離心 5 分鐘（離心速度4000r/min），精密量取上清液15mL, 置50mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，離心 10分鐘（離心速度4000r/min)，精密量取上清液20mL，通過免疫親合柱，流速每分鐘3mL, 用水20mL洗脫(必要時(shí)可以先用淋洗緩沖液10mL洗脫，再用水10mLl洗脫），棄去洗脫液，使空氣進(jìn)人柱子，將水?dāng)D出柱子，再用適量甲醇洗脫, 收集洗脫液，置 2mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0. 22μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。 |
| 進(jìn)樣量 | 混合對(duì)照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl；供試品溶液20~50μl。 |
| 定量方法 | 測(cè)定各對(duì)照品溶液的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；測(cè)定供試品溶液的峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，并計(jì)算出四者總和。 |
2.2 美國(guó)藥典中黃曲霉毒素檢查方法（HPLC法）
| 檢驗(yàn)方法 | 具體內(nèi)容 |
|---|---|
| 色譜柱 | 4.6-mm×15 cm，3-μm填料L1（即十八烷基硅烷鍵合硅膠） |
| 流動(dòng)相 | 水-甲醇-乙腈（60:25:15） |
| 流速 | 0.8 mL/min |
| 柱后衍生化 | 光化學(xué)衍生器（254nm） |
| 檢測(cè)器 | 熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)362nm，發(fā)射波長(zhǎng)440nm |
| 系統(tǒng)適用性 | 洗脫順序?yàn)锳FG2、AFG1、AFB2和AFB1； 將5號(hào)線性對(duì)照溶液5mL加入到5g的樣品中，按“供試品溶液”（甲醇-0.5%碳酸氫鈉（7:3）用量為20mL）處理方法，計(jì)算AFB1（2μg/kg）和黃曲霉毒素（5μg/kg）的平均回收率，應(yīng)分別不低于68%和70%。AFB1和黃曲霉毒素總量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不高于10%。 |
| 免疫親和柱預(yù)處理 | 免疫黃曲霉素柱的總黃曲霉毒素最小容量不低于100ng。將AFB1、AFB2、AFG1和AFG2每個(gè)5ng，溶于10mL 10%甲醇的磷酸鹽緩沖鹽溶液（v/v）中時(shí)，各回收率不低于80%。 |
| 對(duì)照品溶液 | 用乙腈制備AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分別含有2.0、0.50、2.0和0.50μg/mL的混合對(duì)照溶液。首先用乙腈制備標(biāo)示濃度均為10μg/mL的各儲(chǔ)備液，在360nm附近測(cè)定最大吸光度，計(jì)算公式為：黃曲霉毒素濃度（μg/mL）=（A×Mr×1000）/ε，其中A為吸光度，Mr為分子量，ε為摩爾吸收系數(shù)，見附表1。準(zhǔn)確量取一定量黃曲霉毒素各儲(chǔ)備液至同一容量瓶，用乙腈稀釋至規(guī)定濃度。冰箱儲(chǔ)存，使用前平衡至室溫。用甲醇 - 水（1:1）稀釋黃曲霉素對(duì)照溶液，最終濃度見附表2。冰箱保存，使用前平衡至室溫，每日新制。 |
| 供試品溶液 | 取樣品5g，置于50mL離心管中，加入氯化鈉1 g和甲醇 - 0.5%碳酸氫鈉（7:3）25 mL。在渦流混合器上混合，直到樣品顆粒和提取溶劑充分混合，400 rpm振搖10min，7000 rpm離心10min，立即取7 mL至50 mL離心管中，加入0.1 M磷酸鹽緩沖溶液28 mL，混合，過濾，收集25mL濾液（相當(dāng)于1g樣品）到25mL刻度量筒中，并立即上IAC柱。[注：對(duì)于IAC柱在使用前必須在室溫下至少平衡15分鐘。]從小柱上取下頂蓋，并將其與儲(chǔ)液罐連接。從柱上拆下端蓋，并將其連接到柱歧管上（必須擰緊）。讓柱中的液體通過，直到液體高出柱床約2~3 mm。將濾液25mL倒入儲(chǔ)液罐。讓液體自然流過柱子，讓柱子流干。為了便于再次開始流動(dòng)，從歧管上取下色譜柱，向柱中加入磷酸鹽緩沖鹽溶液約2 mL，將色譜柱重新連接到儲(chǔ)液罐上，然后用磷酸鹽緩沖鹽溶液3mL和水5mL清洗色譜柱（如果使用其他技術(shù)去除柱末端的氣泡并很容易重新開始流動(dòng)，則可將磷酸鹽緩沖鹽溶液5mL直接加入到柱儲(chǔ)液罐中）。讓柱子流干，然后用注射器注入3mL空氣通過柱子，用甲醇1mL洗脫，并用3mL容量瓶中收集洗脫液，使洗脫液自由滴落。讓柱子流干。靜置1分鐘，然后用額外的甲醇1mL洗脫，并收集在同一容量瓶中。讓柱子流干，并注入10mL空氣通過柱子，用水稀釋洗脫液至刻度，立即進(jìn)行分析。 |
| 進(jìn)樣量 | 50μl |
| 定量方法 | 毒素（μg/kg）={[（R?a）/S]×V/W}×F R=樣品溶液的峰面積；a=校準(zhǔn)曲線的y截距；S=校準(zhǔn)曲線的斜率；V=樣品溶液的最終體積（mL）；W=通過免疫柱的供試品1g；F=稀釋系數(shù)，V=3 mL時(shí)為1；黃曲霉毒素的總量是AFG1、AFG2、AFB1和AFB2的總和。 |
2.3 歐洲藥典中黃曲霉毒素檢查方法（HPLC法）
| 檢驗(yàn)方法 | 具體內(nèi)容 |
|---|---|
| 色譜柱 | 柱長(zhǎng)0.25m，直徑4.6mm，十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相（5-μm） |
| 流動(dòng)相 | 乙腈-甲醇-水(2:3:6) |
| 流速 | 1.0mL/min |
| 柱后衍生化 | 光化學(xué)衍生器（254nm） |
| 檢測(cè)器 | 熒光檢測(cè)器檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)= 365nm，發(fā)射波長(zhǎng)Aem =435nm。 |
| 系統(tǒng)適用性 | 出峰順序：G2、G1、B2、B1；需滿足驗(yàn)證要求。 |
| 對(duì)照品溶液 | 用甲苯-乙腈(98:2)制備10μg/mL AFB1貯備溶液，并在330nm~370nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定吸收曲線，計(jì)算公式為：黃曲霉毒素濃度（μg/mL）=（A×M×100）/ε，其中A為紫外吸收曲線上的最大吸光度，M為B1的分子量（312g/mol），ε為摩爾吸收系數(shù)（1930m2/mol）。用甲苯-乙腈(98:2)將初級(jí)貯備液稀釋為100ng/mL的次級(jí)貯備液，用鋁箔緊密包好后，置于4℃儲(chǔ)存，使用前，待溶液恢復(fù)至室溫后才能取下鋁箔。使用前后記錄容量瓶的重量。按附表3制備系列對(duì)照溶液，將所需體積的次級(jí)貯備液置于250mL容量瓶中，氮?dú)獯蹈?，加入甲?5mL溶解黃曲霉毒素B1，并用水稀釋至刻度。 |
| 免疫親和柱預(yù)處理 | 免疫親和柱對(duì)黃曲霉毒素B1的容量不低于100 ng。將AFB1 5 ng，溶于12.5mL甲醇和87.5 mL 水中時(shí)，回收率不低于80%。使用前平衡至室溫。 |
| 供試品溶液 | 取本品粉末5.00g，加入甲醇:水(70:30)混合溶液100mL，超聲處理30min，取濾液10mL至150mL錐形瓶，并加入水70mL。取40mL以流速3mL/min（不得超過5mL/min）通過免疫親和柱。用水以流速5mL/min沖洗小柱兩次，每次10mL. 用注射器注入空氣10s。取甲醇5mL注入小柱，并保持自然流出，收集洗脫液至5mL容量瓶中，1min后，注入甲醇0.5mL ，再隔1min后，注入甲醇0.5mL，每次加入甲醇后，均通過注入空氣收集洗脫液，用水稀釋至容量瓶刻度，搖勻。溶液澄清的話，可直接用于分析；否則應(yīng)過濾處理，并確保黃曲霉毒素沒有損失。 |
| 進(jìn)樣量 | 500μl |
| 定量方法 | 用黃曲霉毒素B1系列對(duì)照溶液1~5做標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品濃度超出線性范圍，則需要做相應(yīng)稀釋。 毒素（μg/kg）=[（R?b）/a]×V /W R=樣品溶液的峰面積；b=校準(zhǔn)曲線的截距；a=校準(zhǔn)曲線的斜率；V稀釋倍數(shù)；W=通過免疫柱的供試品g；黃曲霉毒素的總量是AFG1、AFG2、AFB1和AFB2的總和。 |
2.4 上述方法中的三個(gè)附表
| 附表1 | |||
|---|---|---|---|
| 黃曲霉毒素 | M | 溶劑 | ε |
| AFB1 | 312 | 乙腈 | 20700 |
| AFB2 | 314 | 乙腈 | 22500 |
| AFG1 | 328 | 乙腈 | 17600 |
| AFG2 | 33 | 乙腈 | 18900 |
| 附表2 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 序號(hào) | 黃曲霉素對(duì)照溶液加入量(μl) | 黃曲霉素工作對(duì)照溶液（ng/ml） | ||||
| AFB1 | AFB2 | AFG1 | AFG2 | 總和 | ||
| 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2 | 12.5 | 0.25 | 0.0625 | 0.25 | 0.0625 | 0.625 |
| 3 | 25 | 0.5 | 0.125 | 0.5 | 0.125 | 1.25 |
| 4 | 50 | 1 | 0.25 | 1 | 0.25 | 2.5 |
| 5 | 100 | 2 | 0.5 | 2 | 0.5 | 5 |
| 6 | 200 | 4 | 1 | 4 | 1 | 10 |
| 附表3 | ||
|---|---|---|
| 系列對(duì)照溶液 | 加入次級(jí)貯備液的體積(μl) | 對(duì)照溶液的最終濃度(ng/ml) |
| 1 | 125 | 0.05 |
| 2 | 250 | 0.1 |
| 3 | 500 | 0.2 |
| 4 | 750 | 0.3 |
| 5 | 1000 | 0.4 |
3、注意事項(xiàng)
由于黃曲霉毒素的毒性，實(shí)驗(yàn)過程必須小心謹(jǐn)慎，小編總結(jié)出4條注意事項(xiàng)，供大家參考：
1、使用真菌毒素對(duì)照品，必須穿好防護(hù)服，帶好手套，在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，并將工作臺(tái)蓋上膠布。非實(shí)驗(yàn)人員未經(jīng)允許，不得進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，以免發(fā)生意外。
2、黃曲霉毒素容易光降解，實(shí)驗(yàn)過程需要避光，對(duì)照品和供試品溶液也需要避光保存，線性對(duì)照溶液需要臨用現(xiàn)配。
3、真菌毒素為痕量分析，易受環(huán)境污染，應(yīng)隨行進(jìn)行空白試驗(yàn)與加樣回收率實(shí)驗(yàn)。
4、用過的玻璃儀器需用次氯酸鈉溶液浸泡2小時(shí)。
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