1  范圍 本規(guī)范規(guī)定了化妝品微生物學(xué)檢驗(yàn)的基本要求。

本規(guī)范適用于化妝品樣品的采集、保存及供檢樣品制備。

2  儀器和設(shè)備

2.1 天平。

2.2 高壓滅菌器。

2.3 振蕩器。

2.4 三角瓶，250mL。

2.5 玻璃珠。

2.6 玻璃棒。

2.7 刻度吸管，1mL、10mL。

2.8 研缽或均質(zhì)器。

2.9 恒溫水浴箱。

3  培養(yǎng)基和試劑

3.1 生理鹽水

成分：

氯化鈉       8.5g
蒸餾水加至1000mL

溶解后，分裝到加玻璃珠的三角瓶內(nèi)，每瓶  90mL，103.43kPa（121℃  15  lb）20min

高壓滅菌。

3.2 SCDLP 液體培養(yǎng)基

成分：

酪蛋白胨 17g 
大豆蛋白胨 3g 
氯化鈉 5g 
磷酸氫二鉀 2.5g 
葡萄糖         2.5g 
卵磷脂 1g 
吐溫  80 7g 
蒸餾水 1000mL 

制法：先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后，再與其它成分混合，加熱溶解，調(diào) pH

為 7.2～7.3 分裝，103.43kPa（121℃  15  lb）20min 高壓滅菌。注意振蕩，使沉淀于底層的 吐溫 80 充分混合，冷卻至 25℃左右使用。

注：如無酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。

3.3 滅菌液體石蠟。

3.4 滅菌吐溫 80。

3.5 7.5％的氯化鈉肉湯

成分：

蛋白胨 10g 
牛肉膏 3g 
氯化鈉 75g 
蒸餾水加至 1000mL 

制法：將上述成分加熱溶解，調(diào) pH 為 7.4，分裝，103.43kPa（121℃  15  lb）15min 高 壓滅菌。

3.6 Baird Parker 平板

成分：

胰蛋白胨 10g 
牛肉膏 5g 
酵母浸膏 1g 
丙酮酸鈉 10g 
甘氨酸 12g 
氯化鋰（LiCl·6H2O） 5g 
瓊脂 20g 
蒸餾水 950mL 

pH7.0±0.2

增菌劑的配制：30％卵黃鹽水 50mL 與除菌過濾的 1％亞碲酸鉀溶液 10mL 混合，保存 于冰箱內(nèi)。

制法：將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸完全溶解，冷至  25℃±1℃校正  pH。分裝每瓶 95mL，103.43kPa（121℃  15 lb）高壓滅菌 15min。臨用時(shí)加熱溶化瓊脂，每 95mL 加入 預(yù)熱至 50℃左右的卵黃亞碲酸鉀增菌劑 5mL，搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。 使用前在冰箱貯存不得超過 48h±2h。

3.7 血瓊脂培養(yǎng)基

成分：

營養(yǎng)瓊脂 100mL 
脫纖維羊血（或兔血） 10mL

制法：將營養(yǎng)瓊脂加熱融化，待冷至  50℃左右無菌操作加入脫纖維羊血，搖勻，制成 平板，置冰箱內(nèi)備用。

3.8 甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基

成分：

蛋白胨 10g 
氯化鈉 5g 
甘露醇 10g 
牛肉膏 5g 
0.2％麝香草酚藍(lán)溶液 12mL 
蒸餾水 1000mL

制法：將蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào) pH7.4，加入甘露醇和 指示劑，混勻后分裝試管中，68.95kPa（115℃  10 lb）20min 滅菌備用。

3.9 兔（人）血漿制備

取 3.8％檸檬酸鈉溶液，103.43kPa（121℃  15  lb）30min 高壓滅菌，1 份加兔（人）全血 4 份，混勻靜置；2000rpm～3000rpm 離心 3min～5min。血球下沉，取上面血漿。

4  樣品的采集及注意事項(xiàng)

4.1 所采集的樣品，應(yīng)具有代表性，一般視每批化妝品數(shù)量大小，隨機(jī)抽取相應(yīng)數(shù)量的包裝單位。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別從兩個(gè)包裝單位以上的樣品中共取 10g 或 10mL。包裝量小于 20g

的樣品，采樣量可適當(dāng)增加樣品包裝數(shù)量。

4.2 供檢驗(yàn)樣品，應(yīng)嚴(yán)格保持原有的包裝狀態(tài)。容器不應(yīng)有破裂，在檢驗(yàn)前不得打開，防 止樣品被污染。

4.3 接到樣品后，應(yīng)立即登記，編寫檢驗(yàn)序號，并按檢驗(yàn)要求盡快檢驗(yàn)。如不能及時(shí)檢驗(yàn)， 樣品應(yīng)放在室溫陰涼干燥處，不要冷藏或冷凍。

4.4 若只有一個(gè)樣品而同時(shí)需做多種分析，如細(xì)菌、毒理、化學(xué)等，則宜先取出部分樣品 做細(xì)菌檢驗(yàn)，再將剩余樣品做其它分析。

4.5 在檢驗(yàn)過程中，從打開包裝到全部檢驗(yàn)操作結(jié)束，均須防止微生物的再污染和擴(kuò)散， 所用器皿及材料均應(yīng)事先滅菌，全部操作應(yīng)在無菌室內(nèi)進(jìn)行，或在相應(yīng)條件下，按無菌操作 規(guī)定進(jìn)行。

4.6 如檢出糞大腸菌群或其它致病菌，自報(bào)告發(fā)出之日起該菌種及被檢樣品應(yīng)保存一個(gè)月。

5  供檢樣品的制備

5.1 液體樣品

5.1.1水溶性的液體樣品，可量取 10mL 加到 90mL 滅菌生理鹽水中，如樣品少于 10mL， 仍按 10 倍稀釋法進(jìn)行。如為 5mL 則加到 45mL 滅菌生理鹽水，混勻后，制成 1：10 檢液。

5.1.2油性液體樣品，取樣品 10mL，先加 5mL 滅菌液體石蠟混勻，再加 10mL滅菌的吐

溫 80，在 40℃～44℃水浴中振蕩混合 10min，加入滅菌的生理鹽水 75mL（在 40℃～44℃ 水浴中預(yù)溫），在 40℃～44℃水浴中乳化，制成 1：10 的懸液。

5.2 膏、霜、乳劑半固體狀樣品

5.2.1親水性的樣品：稱取10g，加到裝有玻璃珠及 90mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，充分 振蕩混勻，靜置 15min。用其上清液作為 1:10 的檢液。

5.2.2疏水性樣品：稱取10g，放到滅菌的研缽中，加 10mL 滅菌液體石蠟，研磨成粘稠狀， 再加入 10mL 滅菌吐溫 80，研磨待溶解后，加 70mL 滅菌生理鹽水，在40℃～44℃水浴中 充分混合，制成 1：10 檢液。

5.3 固體樣品

稱取 10g，加到 90mL 滅菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，使其分散混懸，靜置后，取上 清液作為 1：10 的檢液。

如有均質(zhì)器，上述水溶性膏、霜、粉劑等，可稱  10g  樣品加入  90mL滅菌生理鹽水， 均質(zhì) 1min～2min；疏水性膏、霜及眉筆、口紅等，稱 10g 樣品，加 10mL滅菌液體石蠟，

10mL 吐溫 80，70mL 滅菌生理鹽水，均質(zhì) 3min～5min。

6  操作步驟

6.1 增菌：取 1：10 稀釋的樣品接種到 90mL SCDLP 液體培養(yǎng)基中，置36℃±1℃培養(yǎng)箱， 培養(yǎng) 24h±2h。

注：如無此培養(yǎng)基也可用 7.5％氯化鈉肉湯。

6.2    分離：自上述增菌培養(yǎng)液中，取 1～2  接種環(huán)，劃線接種在Baird Parker 氏培養(yǎng)基，如 無此培養(yǎng)基也可劃線接種到血瓊脂平板，置36℃±1℃培養(yǎng) 24h～48h。在血瓊脂平板上菌落 呈金黃色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。在 Baird Parker 氏培養(yǎng)基 上為圓形，光滑，凸起，濕潤，直徑為  2mm～3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周 圍為一混濁帶，在其外層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的軟度。偶然會遇到 非脂肪溶解的類似菌落，但無混濁帶及透明帶。挑取單個(gè)菌落分純在血瓊脂平板上，置  36℃±1℃培養(yǎng) 24h±2h。

6.3 染色鏡檢：挑取分純菌落，涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。金黃色葡萄球菌為革蘭氏 陽性菌，排列成葡萄狀，無芽胞，無夾膜，致病性葡萄球菌，菌體較小，直徑約為 0.5?m～1?m。

6.4 甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)：取上述分純菌落接種到甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基液面上加入2mm～3mm的滅菌液體石蠟，置36℃±1℃培養(yǎng) 24h±2h，金黃色葡萄球菌應(yīng)能發(fā)酵甘露醇 產(chǎn)酸。

5.5 血漿凝固酶試驗(yàn)：吸取 1:4 新鮮血漿 0.5mL，放入滅菌小試管中，加入待檢菌 24h±2h 肉湯培養(yǎng)物 0.5mL。混勻，放36℃±1℃恒溫箱或恒溫水浴中，每半小時(shí)觀察一次，6h 之內(nèi) 如呈現(xiàn)凝塊即為陽性。同時(shí)以已知血漿凝固酶陽性和陰性菌株肉湯培養(yǎng)物及肉湯培養(yǎng)基各0.5mL，分別加入滅菌 1:4 血漿 0.5mL，混勻，作為對照。

6  檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告 凡在上述選擇平板上有可疑菌落生長，經(jīng)染色鏡檢，證明為革蘭氏陽性葡萄球菌，并能

發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸，血漿凝固酶試驗(yàn)陽性者，可報(bào)告被檢樣品檢出金黃色葡萄球菌。

我公司針對標(biāo)準(zhǔn)的修改，擴(kuò)充完善了微生物檢測試劑，推出了成套的《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》（2007年版）金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)解決方案，為生產(chǎn)企業(yè)及檢測機(jī)構(gòu)（部門）提供方便。

圖1：《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》（2007年版）金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)流程圖