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      需氧芽孢總數(shù)測定¹
      嗜熱需氧芽孢總數(shù)測定²

農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1331-2007標(biāo)準(zhǔn)中的定義：

需氧芽孢總數(shù) total aerobic bacterial spores 指在有氧條件下，經(jīng)80℃加熱處理10min，能存活并且于36℃下培養(yǎng)48h在MPC瓊脂平板上形成可計(jì)數(shù)的菌落總數(shù)。

嗜熱需氧芽孢 thermophilic aerobic bacterial spores 指在有氧條件下，經(jīng)100℃加熱處理30min，能存活并且于55℃下培養(yǎng)48h在DTA平板上形成可計(jì)數(shù)菌落的微生物。

芽孢菌污染是現(xiàn)代乳制品生產(chǎn)加工過程中的污染之一。

原料乳、消毒奶、煉乳、奶粉中，均不同程度的耐熱需氧和厭氧芽孢桿菌污染，如果這些耐熱菌在奶制品中達(dá)到一定濃度，必然引起奶制品變質(zhì)，它們會(huì)導(dǎo)致乳與乳制品品質(zhì)下降、風(fēng)味改變、保質(zhì)期縮短及加工過程異常等，甚至危害人體健康。

01 污染源 ：① 乳的良好營養(yǎng)適宜微生物生長。據(jù)報(bào)道，芽孢桿菌屬在原料乳中污染最嚴(yán)重。芽孢是某些細(xì)菌在生長發(fā)育后期，在細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)圓形或橢圓形的抗逆性休眠體。② 農(nóng)場中的飼料、±壤和糞便等易受芽孢菌污染，牛舍周圍也廣泛存在芽孢菌，這些菌易污染奶牛乳頭表面，使原料乳污染芽孢菌。

02 影響 ：這些耐熱菌在奶制品中達(dá)到一定濃度，必然引起奶制品變質(zhì)，它們會(huì)導(dǎo)致乳與乳制品品質(zhì)下降、風(fēng)味改變、保質(zhì)期縮短及加工過程異常等，甚至危害人體健康。

03 檢測原理：將樣品加熱處理以除去非芽孢菌，然后向樣液中加入能為芽孢菌提供豐富營養(yǎng)的乳平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，放入合適環(huán)境下培養(yǎng)，最后計(jì)數(shù)。

需氧芽孢總數(shù)測定

一、標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)：農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1331-2007《乳與乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數(shù)的測定》中第二部分：需氧芽孢總數(shù)測定。

二、原理：取一定量的液體檢樣或檢樣的初級(jí)稀釋液，將其在80℃下加熱10min，在MPC瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，于36℃條件下培養(yǎng)48 h，菌落計(jì)數(shù)，算出每毫升(克)檢樣中的需氧芽孢總數(shù)。

三、檢測程序

四、接種及培養(yǎng)

1 檢樣處理

1.1 以無菌操作打開待檢樣品包裝容器，液體樣品應(yīng)避免形成泡沫。

1.2 以無菌操作稱取固體或半固體檢樣10g(或25g)于含有90mL(或225 mL)預(yù)熱至45℃的滅菌稀釋液(蛋白胨-鹽溶液或磷酸鹽緩沖液)的三角燒瓶中(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)，經(jīng)充分振搖(必要時(shí)用均質(zhì)器均質(zhì)或無菌乳缽研磨)制成10^-1初級(jí)稀釋液。

2 加熱處理

2.1 用無菌吸管吸取液體檢樣、固體或半固體檢樣的初級(jí)稀釋液5mL~10mL于無菌試管中，注意不應(yīng)使樣液接觸到超出水面和位于水面下2cm以內(nèi)的試管內(nèi)壁。

2.2 立即將上述試管放人80℃±1℃的水浴中，使試管內(nèi)液面至少低于水面4cm。

2.3 加熱處理10min±1min。在對(duì)照管中放一支溫度計(jì)測定溫度。試管內(nèi)樣液的升溫時(shí)間不應(yīng)超過5min。

2.4 將加熱處理后的試管取出立即放到20℃以下的流水中冷卻。

3 進(jìn)一步稀釋液的制備

用一支1mL無菌吸管，吸取1mL經(jīng)加熱處理的樣液，于含有9mL無菌稀釋液的試管中，振搖試管，混合均勻,，獲得其10倍稀釋液(液體檢樣10^-1稀釋液或固體檢樣10^-2稀釋液)。按上述操作方法，做10倍遞增稀釋，如此每遞增稀釋一次，換用一支1mL無菌吸管。

4 接種和培養(yǎng)

4.1 根據(jù)對(duì)樣品中芽孢含量的估計(jì)，選擇適宜的稀釋度，即通過正確地選擇，使得在培養(yǎng)結(jié)束后至少有一個(gè)培養(yǎng)皿里長出10個(gè)~150個(gè)菌落。分別在做10倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該稀釋度的吸管移1mL該稀釋液于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度接種兩個(gè)培養(yǎng)皿。

4.2 立即傾注12mL~15mL已融化并冷卻至45℃±1℃的MPC瓊脂培養(yǎng)基到每個(gè)培養(yǎng)皿中。

4.3 小心地轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使接種樣液和培養(yǎng)基混合均勻，水平放置使混合物凝固。從熱處理結(jié)束到接種樣液和培養(yǎng)基混合所用的時(shí)間不得超過15min。

4.4 接種樣液的同時(shí)，用1mL稀釋液，作空白試驗(yàn)。

4.5 待瓊脂凝固后，堆疊培養(yǎng)皿，倒置在培養(yǎng)箱中，于36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h。

注：為了避免菌落蔓延使得無法計(jì)數(shù)，可采取以下措施：
      ① 待培養(yǎng)皿里的混合物凝固后，于其上再鋪一層(約5mL)還保持液體狀態(tài)的該培養(yǎng)基；
      ② 待培養(yǎng)皿里的混合物凝固后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，于培養(yǎng)皿的蓋子里放一片濾紙并在濾紙上漓幾滴甘油。

五、菌落計(jì)數(shù) 

1 做平板菌落計(jì)數(shù)時(shí)，可用肉眼觀察，需要時(shí)用放大鏡檢查。

2 蔓延的菌落被認(rèn)為是單一菌落。如果被蔓延菌落所覆蓋的部分不到平板面積的1/4，計(jì)數(shù)未受影響的平板部分的菌落并計(jì)算出整個(gè)平板的相對(duì)量。如果被蔓延菌落所覆蓋的部分超過了平板面積的1/4，不應(yīng)計(jì)數(shù)。

六、結(jié)果計(jì)算 

1 保留含有10個(gè)~150個(gè)菌落的培養(yǎng)皿。

用公式(2)計(jì)算每毫升或每克樣品中需氧芽孢總數(shù)：

2 如果所有稀釋度培養(yǎng)皿中菌落數(shù)均少于10個(gè)，結(jié)果報(bào)告為“樣品中需氧芽孢總數(shù)小于10×1/d CFU/mL(g)”，式中d為最低稀釋液的稀釋度。

3 如果所有稀釋度培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)均多于150個(gè)，結(jié)果報(bào)告為“樣品中需氧芽孢總數(shù)大于150×1/d CFU/mL(g)" ，式中d為最高稀釋液的稀釋度。

嗜熱需氧芽孢總數(shù)測定

一、標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)：農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1331-2007《乳與乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數(shù)的測定》中第三部分：嗜熱需氧芽孢總數(shù)測定。

二、原理：取一定量的液體檢樣或檢樣的初級(jí)稀釋液,，將其在100℃下加熱30min，在DTA培養(yǎng)基內(nèi)，于55℃條件下培養(yǎng)48h，菌落計(jì)數(shù)，算出每毫升(克)檢樣中的嗜熱需氧芽孢數(shù)。

三、檢測程序

四、接種及培養(yǎng)

1 檢樣處理

1.1 以無菌操作打開待檢樣品包裝容器，液體樣品應(yīng)避免形成泡沫。

1.2 以無菌操作稱取固體或半固體檢樣10g(或25g)于含有90mL(或225 mL)預(yù)熱至45℃的滅菌稀釋液(蛋白胨-鹽溶液或磷酸鹽緩沖液)的三角燒瓶中(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠) ，經(jīng)充分振搖(必要時(shí)用均質(zhì)器均質(zhì)或無菌乳缽研磨)制成10^-1初級(jí)稀釋液。

2 加熱處理

2.1 用無菌吸管吸取液體檢樣、固體或半固體檢樣的初級(jí)稀釋液5mL~ 10mL于無菌試管中，注意不應(yīng)使樣液接觸到超出水面和位于水面下2cm以內(nèi)的試管內(nèi)壁。

2.2 立即將上述試管放入100℃的水浴中，使試管內(nèi)液面至少低于水面4 cm。

2.3 加熱處理30min±1min，從試管放人100℃水浴中開始計(jì)時(shí)。

2.4 將加熱處理后的試管取出立即放到20℃以下的流水中冷卻。

3 進(jìn)一步稀釋液的制備

如果有必要，取一支1mL無菌吸管，吸取1mL經(jīng)加熱處理的樣液于含有9mL無菌稀釋液的試管中，振搖試管，混合均勻，獲得其10倍稀釋液(液體檢樣10^-1稀釋液或固體檢樣10^-2稀釋液)。

4 接種和培養(yǎng)

4.1 根據(jù)對(duì)樣品中嗜熱需氧芽孢含量的估計(jì)，選擇適宜的稀釋度，即通過正確地選擇，使得在培養(yǎng)結(jié)束后至少有一個(gè)培養(yǎng)皿里長出10個(gè)~150個(gè)菌落。分別在做10倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該稀釋度的吸管移1mL該稀釋液于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度接種兩個(gè)培養(yǎng)皿。

注：在每毫升(克)乳或乳制品中，常常只有少量的嗜熱需氧芽孢。如果想測出它們的數(shù)量，可以采取以下措施：
      ① 在多個(gè)培養(yǎng)皿里接種足夠量的經(jīng)加熱處理的液體樣品或經(jīng)加熱處理的初級(jí)稀釋液；
      ② 使用更大的培養(yǎng)皿，以能夠在其中接種多于1mL經(jīng)加熱處理的液體樣品或經(jīng)加熱處理的初級(jí)稀釋液。
在報(bào)告結(jié)果時(shí)，必須要注明對(duì)檢測方法進(jìn)行的調(diào)整。

4.2 立即傾注12mL~15mL已融化并冷卻至45℃±1℃的DTA培養(yǎng)基到每個(gè)培養(yǎng)皿中。

4.3 小心地轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使接種樣液和培養(yǎng)基混合均勻，水平放置使混合物凝固。從熱處理結(jié)束到接種樣液和培養(yǎng)基混合所用的時(shí)間不得超過15min。

4.4 接種樣液的同時(shí)，用1mL稀釋液作空白試驗(yàn)。

4.5 待瓊脂凝固后，堆疊培養(yǎng)皿，把其倒置在塑料袋里，然后將其放人培養(yǎng)箱中，于55℃±1℃培養(yǎng)48h±2h。

注：為了避免菌落蔓延使得無法計(jì)數(shù)，可采取以下措施：
      ① 待培養(yǎng)皿里的混合物凝固后，于其上再鋪一層(約5mL)還保持液體狀態(tài)的該培養(yǎng)基；
      ② 待培養(yǎng)皿里的混合物凝固后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，于培養(yǎng)皿的蓋子里放一片濾紙并在濾紙上滴幾滴甘油。

五、菌落計(jì)數(shù) 

1 做平板菌落計(jì)數(shù)時(shí)，可用肉眼觀察,需要時(shí)用放大鏡檢查。

2 蔓延的菌落被認(rèn)為是單一菌落。如果被蔓延菌落所覆蓋的部分不到平板面積的1/4，計(jì)數(shù)未受影響的平板部分的菌落并計(jì)算出整個(gè)平板的相對(duì)量。如果被蔓延菌落所覆蓋的部分超過了平板面積的1/4，不應(yīng)計(jì)數(shù)。

六、結(jié)果計(jì)算 

1 保留含有10個(gè)~150個(gè)菌落的培養(yǎng)皿。

用公式(3)計(jì)算每毫升或每克樣品中嗜熱需氧芽孢總數(shù)：

2 如果所有稀釋度培養(yǎng)皿中菌落數(shù)均少于10個(gè)，結(jié)果報(bào)告為“樣品中嗜熱需氧芽孢總數(shù)小于10×1/d CFU/mL(g)”，式中d為最低稀釋液的稀釋度。

3 如果所有稀釋度培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)均多于150個(gè)，結(jié)果報(bào)告為“樣品中嗜熱需氧芽孢總數(shù)大于150×1/d CFU/mL(g)" ，式中d為最高稀釋液的稀釋度。

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