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單核細胞增生李斯特氏菌的生物學特性
生物學特性：單核細胞增生李斯特氏菌為革蘭氏陽性短桿菌，營養(yǎng)需求不高，兼性厭氧。該菌觸酶陽性，有動力，具有溶血反應、能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖和七葉苷，不能發(fā)酵甘露醇和木糖，MR-VP陽性。
流行學特征：單核細胞增生李斯特菌是一種人畜共患病原菌，它的臨床癥狀為菌血癥、腦膜炎及導致孕婦流產(chǎn)。單核細胞增生李斯特菌廣泛分布存在于自然界，可以加熱殺死，但是對高濃度鹽和酸相對不敏感。它還能在冰箱溫度和真空包裝內(nèi)增殖，特別有風險的材料包括生或加工肉類、生牛奶產(chǎn)品、生或熏魚、預制沙拉和長期真空儲存的包裝食物。
單核細胞增生李斯特氏菌的國標檢驗方法
操作注意事項
1：對易產(chǎn)生較大顆粒的樣品（如肉類）進行檢測時，建議使用帶濾網(wǎng)均質(zhì)袋，以便均質(zhì)后用吸管吸取勻液；
2：預增菌時間與樣品種類、目標菌和雜菌的含量及狀態(tài)等因素有關。一般菌相比較復雜的高污染樣品，如果增菌時間過長會導致雜菌生長過多，目標菌可能就會被另一種優(yōu)勢菌所取代，這種情況下，增菌時間不宜過長。低污染樣品的增菌時間可以適當延長。由于本標準適用的樣品種類眾多，預增菌的時間應根據(jù)實際情況和經(jīng)驗進行具體選擇。建議增菌液發(fā)生混濁時停止預增菌。
3：分離劃線用直徑3mm的接種環(huán)（1環(huán)約10微升）。
4：動力試驗的培養(yǎng)溫度不能超過30℃。
操作難點1-可疑菌落的識別
1）PALCAM培養(yǎng)基
可疑菌落特征：在PALCAM 瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落,周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。
疑點：單核細胞增生李斯特氏菌與屬內(nèi)其他李斯特氏菌菌落特征無明顯差別，可疑菌落多，后續(xù)確證工作量大。
2）CRM014 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基
可疑菌落特征：單核細胞增生李斯特氏菌形成藍綠色規(guī)測光滑的小菌落，周圍有乳白色脂肪沉淀環(huán)；其他李斯特氏菌為藍綠色無暈圈菌落；雜菌被抑制或顯示其他顏色。
疑點：乳白色脂肪沉淀環(huán)擴散覆蓋其他菌落時極易引起假陽性。
操作難點一的解決方案：
1）CRM013 單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基
可疑菌落特征：單核細胞增生李斯特氏菌形成藍綠色規(guī)測光滑的小菌落；其他李斯特氏菌為無色菌落；雜菌被抑制或顯示其他顏色。
李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基與單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基的對比
CRM013 單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基的優(yōu)勢
配制簡便：添加劑易溶，克服李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基配制不當所致暈圈特征不明顯問題，同時節(jié)省了時間和減少了勞動強度。
特異性極強：對于陰性菌有著很好的抑制作用；對于有害李斯特菌和無害李斯特菌，有著很好的分辨能力和靈敏度；
結果易讀：顏色清晰易辯，結果一目了然；
準確率高：能避免假陽性及假陰性結果。
操作難點二：可疑菌落鑒定
1）革蘭氏染色鏡檢：李斯特氏菌為革蘭氏陽性短桿菌。
2）動力試驗：李斯特氏菌有動力,在半固體或SIM培養(yǎng)基上方呈傘狀生長,如傘狀生長不明顯,可繼續(xù)培養(yǎng)5再觀察結果
3）過氧化氫酶試驗：李斯特氏菌過氧化氫酶陽性反應
4）傳統(tǒng)生化試驗：七葉苷、甘露醇、葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖磷酸鹽胨水（MR/VP）
5）溶血試驗：單增李斯特氏菌呈現(xiàn)狹窄、清晰、明亮的溶血圈；斯氏李斯特氏菌在刺種點周圍產(chǎn)生弱的透明溶血圈；英諾克李斯特氏菌無溶血圈；伊氏李斯特氏菌產(chǎn)生寬的、輪廓清晰的β-溶血區(qū)域。若結果不明顯，可置4℃冰箱24h~48h再觀察。
注意事項：穿刺時盡量接近底部，但不要觸到底面，同時避免瓊脂破裂，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24h~48h，于明亮處觀察。
6）協(xié)同溶血試驗cAMP（可選做項目）
實驗操作：在血瓊脂平板上平行劃線接種金黃色葡萄球菌和馬紅球菌，挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落垂直劃線接種于平行線之間，垂直線兩端不要觸及平行線，距離1~2mm，于36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h。
結果判讀：單核細胞增生李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌處出現(xiàn)約2mm 的β-溶血增強區(qū)域，斯氏李斯特氏菌也出現(xiàn)微弱的溶血增強區(qū)域，伊氏李斯特氏菌在靠近馬紅球菌處出現(xiàn)約5mm~10mm 的“箭頭狀”β-溶血增強區(qū)域，英諾克李斯特氏菌不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。若結果不明顯，可置4 ℃冰箱24h~48h再觀察。
操作難點二解決方案：
1）MID67李斯特氏菌鑒定系統(tǒng)
MID67 李斯特菌鑒定系統(tǒng)優(yōu)點
MID67 中的溶血試驗反應，可替代傳統(tǒng)的血平板溶血試驗和CAMP
MID67 李斯特菌鑒定系統(tǒng)使用流程
最后將數(shù)值編碼輸入MID數(shù)據(jù)庫中檢索，即可獲得鑒定結果。
2）單核細胞增生李斯特氏菌實時熒光PCR快檢法
產(chǎn)品：單核細胞增生李斯特氏菌實時熒光PCR擴增試劑盒
技術原理：基于實時熒光PCR技術，針對檢測目標特異性基因片段設計引物和熒光探針并優(yōu)化反應所需試劑組分，加入待檢樣品核酸即可進行擴增反應。在擴增過程中，熒光探針與目的基因片段結合，可被Taq酶分解并產(chǎn)生熒光信號，此時熒光定量PCR儀可識別該熒光信號，同時根據(jù)其強弱變化繪制出相應的實時擴增曲線，進而判定目標基因是否檢出。
產(chǎn)品優(yōu)勢：快速提取，一步法核酸提取，快速高效，核酸提取效率高； 操作簡單，提供PCR反應體系預混液，直接加樣檢測，無需自行配制； 特異性強，采用高特異性引物及探針，確保實驗準確性； 靈敏度高，采用高效的擴增酶，檢測靈敏度可達10-100copies/test。
產(chǎn)品組成：
組分名稱 | 規(guī)格×數(shù)量 |
| 預混液 | 1mL×1管 |
| 陽性對照 | 200μL×1管 |
| 陰性對照 | 200μL×1管 |
| 裂解液 | 1mL×2管 |
| 說明書 | 1份 |
質(zhì)量控制及疑難解析
一，質(zhì)量控制
1： 實驗室過程中，每批預增菌液、選擇性增菌液、分離平板等都要做空白對照。以掌握檢驗過程中是否存在來自檢驗環(huán)境的污染。
2： 定期使用單核細胞增生李斯特氏菌ATCC19115菌種或等效的其他標準株，在P2實驗室或陽性對照實驗室內(nèi)，用適當?shù)氖称窐悠愤M行陽性對照實驗驗證，污染劑量應控制在10-100CFU/25g，并進行記錄，驗證實驗至少每2個月進行1次。
3：要求對使用的培養(yǎng)基和生化試劑每批均用GB4789.30-2016推薦的陽性和陰性對照標準菌種進行驗證，并做好記錄。
二，疑難解析
Q1： 為什么在沒有典型菌落時仍要挑取非典型菌落進行鑒定？
根據(jù)經(jīng)驗，有少數(shù)單核細胞增生李斯特氏菌在李斯特顯色平板上呈現(xiàn)非典型菌落。
Q2：為什么在PALCAM選擇性平板上挑取典型菌落，鑒定后非單核細胞增生李斯特菌的概率較高？
PALCAM是李斯特菌屬的選擇性平板，根據(jù)經(jīng)驗，環(huán)境存在較多的英諾克李斯特菌，應結合顯色平板，挑取較多的典型菌落鑒定。
Q3：當3個及以上連續(xù)稀釋度的結果均為陽性時，如何選擇？
選擇原則參考Bacteriological Analytical Mannual Appendix 2: Most Probable Number form Serial Dilutions。
Q4：如果前增菌或選擇性增菌結束后，肉湯中未見微生物生長，是否可以終止實驗？
不可以，因為肉眼可見的細菌濃度為107CFU/mL，在此濃度以下，肉眼是不能發(fā)現(xiàn)。
所需培養(yǎng)基試劑
用途 | 貨號 | 名稱 | 規(guī)格 |
增菌液 | 026040 | 瓶（干粉）250g | |
SR0100 | 10支/盒 | ||
SR0110 | 10支/盒 | ||
| CP0490 | LB1增菌液 | 225ml × 6瓶 | |
| CP0500 | 李氏增菌肉湯LB2 | 10ml× 20支 | |
分離平板 | 026070 | 瓶（干粉）250g | |
SR0140 | 10支/盒 | ||
029980 | 盒（平板）90 mm×20 | ||
CRM014 | 1L用量（干粉） | ||
CRM014P1 | 盒（平板）90 mm×20 | ||
CRM013 | 1L用量（干粉） | ||
CRM013P1 | 盒（平板）90 mm×20 | ||
| 026020 | 胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂(TSA-YE) | 瓶（干粉）250g | |
生化鑒定 | HKI008 | 10測試/盒 | |
核酸快速檢測試劑盒 | FZ007BF2 | 48測試/盒 | |
| 鑒定系統(tǒng) | HK-MID-67 | HK-MID李斯特菌鑒定系統(tǒng) | 10測試/盒 |
| 純培養(yǎng) | 026020A | 盒（平板）90 mm×20 | |
| 溶血試驗 | 024070 | 血平板 | 盒（平板）90 mm×20 |
