一、蠟樣芽孢桿菌檢驗的衛(wèi)生學(xué)意義

芽胞桿菌科，芽胞桿菌屬，革蘭氏陽性大桿菌。
● 在自然界分布廣泛，常存在于土壤、灰塵和污水中，植物和許多食品中常見
● 已從多種食品中分離出該菌，包括肉、乳制品、蔬菜、魚、醬油、布丁、米飯及各種甜點。
● 1950年首次在挪威明確報告其致病作用

? 引起食物中毒的原因－腸毒素

部分菌株能產(chǎn)生腸毒素，有致嘔吐型和腹瀉型兩類。
◆ 腹瀉毒素：大分子量蛋白質(zhì)，引發(fā)腹瀉型綜合癥,能在各種食物中形成；
◆ 嘔吐毒素：小分子量、熱穩(wěn)定多肽，100℃ 30min不能被破壞，為引起嘔吐型中毒的致病因素，常在米飯中形成。

臨床表現(xiàn)：
◆ 腹瀉型：潛伏期為8h～16h，主要癥狀為水瀉、腹痛、腹痙攣為主，病程約24h。
◆ 嘔吐型：潛伏期為0.5h～5h，癥狀以惡心、嘔吐為主，病程不超過24h。  

? 蠟樣芽胞桿菌食物中毒特征

● 以夏季（6-10月）為主

● 致病因子為細菌繁殖過程中產(chǎn)生的細菌毒素

● 中毒食品含菌量在10的6次方CFU/g(ml)以上

● 引起中毒的原因常為食品食前保存溫度不當，放置時間較長或食品加熱不當

● 美國 炒米飯
● 歐洲 甜點、肉餅、色拉、奶和肉制品
● 中國 米飯、淀粉類制品

二、蠟樣芽孢桿菌的生物學(xué)特性

兼性好氧。生長溫度范圍20～45℃菌落較大，干燥，灰白色，不透明，圓形，凸起，表面粗糙似磨砂玻璃或融蠟狀，中等擴散。

10℃以下生長緩慢或不生長。50℃時不生長。   

在100℃下加熱20min可破壞這類菌。

三、蠟樣芽孢桿菌的檢驗方法

? 蠟樣芽孢平板計數(shù)法檢驗程序流程

01) 樣品的處理

◆ 稱取25 g樣品至盛有225 mL磷酸緩沖液或0.85%生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000 r/min-10000 r/min均質(zhì)1min-2min，或放入盛有225 mL 稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min-2 min，制成1:10樣品勻液。

02) 液體的稀釋

◆ 用1 mL的無菌吸管或微量移液器吸收1：10樣品勻液1 mL，加到盛有9 mL磷酸鹽緩沖液或0.85%生理鹽水的試管中，充分混勻，制成1：100的樣品勻液。

◆ 按上一步操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液，直至適宜稀釋倍數(shù)

03) 樣品的接種

◆ 選擇2-3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），單個平行實驗中分別吸取0.3 mL、 0.3 mL、 0.4 mL的樣品勻液加入MYP瓊脂平板，一個稀釋梯度兩個平行（共6個板），然后用無菌L棒均勻涂布于整個平板。

04) 分離培養(yǎng)

在通常情況下，涂布之后將平皿靜置10-30min，待樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平板，30℃ ± 1℃培養(yǎng)24h。如果培養(yǎng)物的菌落特征不顯著，則繼續(xù)培養(yǎng)至48h。

從符合計數(shù)要求的毎個平板中至少挑取5個典型菌落（小于5個全選），劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板做純培養(yǎng)，30 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h。   

蠟樣芽孢桿菌在MYP瓊脂平板上生長的典型菌落為直徑2 mm-5 mm，菌落表面粗糙，在深紅色背景下呈現(xiàn)粉紅色或微粉紅色，環(huán)繞產(chǎn)生5 mm，寬的卵磷脂酶沉淀環(huán)。沒有根狀生長特性（蕈狀芽孢桿菌形成根狀生長特征）。

酚紅為pH指示劑；發(fā)酵D—甘露醇產(chǎn)酸使菌落顯黃色；卵黃含有卵磷脂，蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生卵磷脂酶，在菌落周圍產(chǎn)生沉淀環(huán)；多粘菌素B可抑制雜菌的生長。

MYP瓊脂平板劃線接種蠟樣芽孢桿菌	MYP瓊脂平板涂布接種蠟樣芽孢桿菌
MYP瓊脂平板接種蠟樣芽孢桿菌：微粉紅色（表示不利用甘露醇），周圍有白色至淡粉色沉淀環(huán)（表示產(chǎn)卵磷脂酶）

蠟樣芽孢顯色培養(yǎng)基

蠟樣芽孢桿菌在蠟樣芽孢顯色培養(yǎng)基平板上生長的典型菌落為直徑2 mm-5 mm，菌落表面粗糙，中心藍綠色，環(huán)繞產(chǎn)生5 mm，寬的卵磷脂酶沉淀環(huán)。

05) 生化鑒定

接種生化鑒定培養(yǎng)基后36±1℃培養(yǎng)18-24h結(jié)果

◆ 生化試驗：溶菌酶耐性、甘露醇、葡萄糖（厭氧）、淀粉水解、硝酸鹽還原、VP試驗、明膠、動力、西蒙氏檸檬酸鹽。 

革蘭氏染色

◆ 從每個平板上挑取5個典型菌落，如無典型菌落則挑取可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，分別接種于營養(yǎng)瓊脂斜面或平板，30℃ ± 1℃培養(yǎng)24 h,取培養(yǎng)物進行革蘭氏染色和證實試驗。

1、葡萄糖發(fā)酵試驗

將培養(yǎng)物接種到糖發(fā)酵管中，置于厭氧培養(yǎng)箱中36℃ ± 1℃培養(yǎng)24 h，震蕩后肉湯由紅變黃，表明在厭氧條件下蠟樣芽孢桿菌分解葡萄糖。（也可用液體石蠟形成厭氧環(huán)境）。

2、硝酸鹽還原實驗

將培養(yǎng)物接種到硝酸鹽肉湯中，36℃ ± 1℃培養(yǎng)24 h后，加0.25 mL亞硝酸鹽試劑A和0.25 mL亞硝酸鹽試劑 B，在10 min內(nèi)變?yōu)榧t色為陽性反應(yīng)。

3、V-P實驗

將培養(yǎng)物接種到改良V-P培養(yǎng)基中，36℃ ± 1℃培養(yǎng)48h或72h后，2ml培養(yǎng)基中添加1mL 5% α-萘酚乙醇溶液，后加入0.4 mL 40% KOH溶液，靜置15min出現(xiàn)伊紅粉紅色為陽性。（注意1：必須在有氧的情況下反應(yīng)，所以必須充分震搖。2：試劑順序不能顛倒，可能產(chǎn)生假陽性）

4、酪蛋白分解實驗

將培養(yǎng)物接種到酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上，36℃ ± 1℃培養(yǎng)48 h，在靠近菌生長的地方培養(yǎng)基為透明的，則表明酪氨酸倍分解，陰性則繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，結(jié)果仍為陰性的棄去。

酪蛋白分解試驗	溶血試驗
酪蛋白瓊脂平板	血平板
劃線接種蠟樣芽孢桿菌：菌落周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)澄清透明區(qū)（表示產(chǎn)生酪蛋白酶）	劃線接種蠟樣芽孢桿菌：淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀，有完全溶血環(huán)

5、溶菌酶實驗

將培養(yǎng)物接種到0.001%溶菌酶營養(yǎng)肉湯中，另取培養(yǎng)物接種到普通營養(yǎng)肉湯中作對照，36℃ ± 1℃培養(yǎng)24 h，蠟樣芽孢桿菌在本培養(yǎng)基中生長，為陽性反應(yīng)。如出現(xiàn)陰性反應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)24 h,結(jié)果仍為陰性棄去。

6、觸酶試驗

在潔凈的平皿內(nèi)滴加3%過氧化氫溶液2滴，用牙簽或一次性接種環(huán)挑取新鮮培養(yǎng)物放在平皿內(nèi)過氧化氫溶液中，如果半分鐘內(nèi)發(fā)生氣泡者為陽性，不發(fā)生氣泡者為陰性。

7、根狀實驗

挑取單個可疑菌落劃平行直線于經(jīng)室溫干燥1d～2d的營養(yǎng)瓊脂平板上，30 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h～48h，不能超過72h。用蠟樣芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌標準株作為對照進行同步試驗。蕈狀芽胞桿菌呈根狀生長的特征。蠟樣芽胞桿菌呈粗糙山谷狀生長的特征。

8、動力試驗

用接種針挑取培養(yǎng)物穿刺接種于半固體培養(yǎng)基中，30℃ ± 1℃培養(yǎng)24 h。有動力的蠟樣芽孢桿菌沿穿刺線呈擴散生長，而蕈狀芽孢桿菌常呈絨毛狀生長。

9、溶血試驗

將疑似菌點種胰酪胨大豆羊血瓊脂平板TSSB，30℃ ± 1℃培養(yǎng)24 h。有動力的蠟樣芽孢桿菌會觀察到的β-溶血反應(yīng)。蘇云金芽孢桿菌和蕈狀芽孢桿菌呈現(xiàn)弱的溶血現(xiàn)象，而炭疽芽孢桿菌通常為不溶血。

10、蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗

06) 計數(shù)方法

選擇有典型蠟樣芽胞桿菌菌落的平板，且同一稀釋度3個平板所有菌落數(shù)合計在20 CFU～200CFU之間的平板，計數(shù)典型菌落數(shù)。如果出現(xiàn)a）~f）現(xiàn)象按公式（1）計算，如果出現(xiàn)g）現(xiàn)象則按公式（2）計算；

a）只有一個稀釋度的平板菌落數(shù)在20 CFU～200 CFU之間且有典型菌落，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；

b）2 個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在20 CFU～200 CFU之間，但只有一個稀釋度的平板有典型菌落，應(yīng)計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；

c）所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于20 CFU且有典型菌落，應(yīng)計數(shù)最低稀釋度平板上的典型菌落；

d）某一稀釋度的平板菌落數(shù)大于200 CFU且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應(yīng)計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；

e）所有稀釋度的平板菌落數(shù)均大于200 CFU且有典型菌落，應(yīng)計數(shù)最高稀釋度平板上的典型菌落；

f）所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在20 CFU～200 CFU之間且有典型菌落，其中一部分小于20 CFU或大于200CFU時，應(yīng)計數(shù)最接近20 CFU或200 CFU的稀釋度平板上的典型菌落；

g）2 個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在20 CFU～200 CFU之間且均有典型菌落。

公式一：

T----樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)； A---某一稀釋度典型菌落的總數(shù)； B---某一稀釋度鑒定為陽性的菌落數(shù)； C---某一稀釋度用于鑒定試驗的菌落數(shù)； d---稀釋因子。

公式二：

T --- 樣品中蠟樣芽孢桿菌菌落數(shù); A1 --- 第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))典型菌落的總數(shù); B1 --- 第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))鑒定為陽性的菌落數(shù); C1 --- 第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))用于鑒定試驗的菌落數(shù); A2 --- 第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))典型菌落的總數(shù); B2 --- 第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))鑒定為陽性的菌落數(shù); C2 --- 第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))用于鑒定試驗的菌落數(shù); 1.1 --- 計算系數(shù); d   --- 稀釋因子(第一稀釋度)。

07) 結(jié)果與報告

根據(jù)MYP平板上蠟樣芽胞桿菌的典型菌落數(shù)，按4.4中公式（1）、公式（2）計算，報告每g（mL）樣品中蠟樣芽胞桿菌菌數(shù)，以CFU/g（mL）表示；如T值為0，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告。

必要時報告蠟樣芽胞桿菌生化分型結(jié)果。

08) 計算范例