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肉毒梭菌檢驗(yàn)的衛(wèi)生學(xué)意義
產(chǎn)生的神經(jīng)麻痹毒素（肉毒毒素），可引起人和動(dòng)物中毒，依據(jù)其毒素不同，將其分為7種不同的型
分類 | 可引起中毒的肉毒梭菌型 |
引起人群中毒 | A、B、E、F(只發(fā)生于丹麥與美國(guó)) |
引起畜、禽中毒 | C（α、β）、D |
未知 | G |
A、B型分布最廣，土壤，水底均有發(fā)現(xiàn)，C、D多存在于動(dòng)物尸體，E多存在于海洋沉積物中（菌體與芽孢均適應(yīng)于深水低溫）
臨床：常見于豆谷類的發(fā)酵食品，如臭豆腐，豆瓣醬，豆豉等。臘肉，香腸等熏制食品發(fā)現(xiàn)的較少。
潛伏期（與攝入毒素量，毒力和個(gè)體的狀態(tài)有關(guān)）
國(guó)外報(bào)到多為12-36h
國(guó)內(nèi)最短6h，最長(zhǎng)60h
癥狀與體征（主要癥狀都是神經(jīng)麻痹的表現(xiàn)）
非特異性的刺激：頭暈，頭疼，惡心；甚至嘔吐，腹瀉
肉毒特有癥狀：視力減弱，全身無力，語言困難，呼吸困難（直接死因），但神志清醒
由于其生長(zhǎng)特性，家庭制的發(fā)酵食品比較容易成為肉毒梭菌的產(chǎn)生環(huán)境。
肉毒梭菌的生物學(xué)特性
形態(tài)與染色：
? 厭氧性桿狀菌，新鮮培養(yǎng)的革蘭氏為陽性，多形態(tài)性細(xì)菌（直桿狀/稍彎曲）。4~8根周生鞭毛，行動(dòng)遲緩，沒有莢膜。
? 形成芽孢，芽孢比繁殖體寬，卵圓形，位于次級(jí)端，或偶位于中央，常見游離芽孢。
培養(yǎng)特性：
? 固體培養(yǎng)基上形成3mm左右，非正圓形，表面顆粒狀，邊緣不整齊，界限不明顯、絨毛網(wǎng)狀，向外擴(kuò)散。
? 厭氧。
? 生長(zhǎng)溫度25-35°C，生長(zhǎng)pH 6.0~8.2。
? 卵黃平板上有乳濁環(huán)，表面有彩虹薄層。
? 卵黃平板上有乳濁環(huán)，表面有彩虹薄層。肉毒梭菌的生化性狀很不規(guī)律，即使同型，也常常見到株間差異。
肉毒毒素：
肉毒毒素的毒性極強(qiáng)，是最強(qiáng)的神經(jīng)麻痹毒素之一，1克毒素能殺死400萬噸小白鼠，一個(gè)人的致死量不會(huì)大于2微克。但需要注意的是不同物種對(duì)不同毒素的敏感性不同。
肉毒毒素為外毒素，有文獻(xiàn)表明其毒素由菌體表面產(chǎn)生，在菌體成熟或崩解后釋放于環(huán)境中。
本身為大分子蛋白，引起人群中毒的A,B,E三種都可分為兩個(gè)蛋白成分：一個(gè)具有神經(jīng)毒性，一個(gè)為無毒性的血凝素。、
部分肉毒毒素有被激活的性質(zhì)：在腸道中被胰酶激活，導(dǎo)致毒性大幅度提升（常見于E型毒素）
對(duì)許多理化作用是比較不穩(wěn)定的
耐熱：A型60℃，2分鐘加熱，差不多完全破壞，B，E，二型要70℃ 2分鐘加熱才能完全破壞，而C型需要90℃ 2分鐘D型需要70℃40分鐘。
pH：耐酸而不耐堿。
肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗(yàn)
一個(gè)是毒素檢出（更為重要，只有檢出有毒素，才能做出肯定性結(jié)論），一個(gè)是細(xì)菌鑒定。（時(shí)間較長(zhǎng)，延誤治療時(shí)機(jī)）
患者血清是最好的檢樣，但要獲得可供做出診斷的血清，需要看中毒的程度如何和采血的時(shí)間是否合適。
食剩的可疑食品
不得已的情況下，也可采用患者嘔吐物或者胃液。
肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗(yàn)程序
1、增菌培養(yǎng)
◆ 5.3.1 增菌培養(yǎng)與檢出試驗(yàn)
◆ 5.3.1.1 取出庖肉培養(yǎng)基4支和TPGY 肉湯管2支，隔水煮沸10min~15min，排除溶解氧,迅速冷卻，切勿搖動(dòng)，在TPGY 肉湯管中緩慢加入胰酶液至液體石蠟液面下肉湯中，每支1 mL，制備成TPGYT。
◆ 5.3.1.2 吸取樣品勻液或毒素制備過程中的離心沉淀懸浮液2mL接種至庖肉培養(yǎng)基中，每份樣品接種4支，2支直接放置35℃±1℃厭氧培養(yǎng)至5d，另2支放80℃保溫10min，再放置35℃±1℃厭氧培養(yǎng)至5d；同樣方法接種2支TPGYT肉湯管，28℃±1℃厭氧培養(yǎng)至5d。
◆ 注：接種時(shí)，用無菌吸管輕輕吸取樣品勻液或離心沉淀懸浮液，將吸管口小心插入肉湯管底部，緩緩放出樣液至肉湯中，切勿攪動(dòng)或吹氣。
5.3.1.3 檢查記錄增菌培養(yǎng)物的濁度、產(chǎn)氣、肉渣顆粒消化情況，并注意氣味。肉毒梭菌培養(yǎng)物為產(chǎn)氣、肉湯渾濁(庖肉培養(yǎng)基中A 型和B型肉毒梭菌肉湯變黑)、消化或不消化肉粒、有異臭味。
5.3.1.4 取增菌培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)，注意是否有芽胞、芽胞的相對(duì)比例、芽胞在細(xì)胞內(nèi)的位置。
5.3.1.5 若增菌培養(yǎng)物5d無菌生長(zhǎng)，應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)至10d，觀察生長(zhǎng)情況。
5.3.1.6 取增菌培養(yǎng)物陽性管的上清液，按5.2方法進(jìn)行毒素檢出和確證試驗(yàn)，必要時(shí)進(jìn)行定型試驗(yàn)，陽性結(jié)果可證明樣品中有肉毒梭菌存在。
注：TPGYT增菌液的毒素試驗(yàn)無需添加胰酶處理。
2、分離培養(yǎng)
◆ 5.3.2.1 增菌液前處理，吸取1mL增菌液至無菌螺旋帽試管中，加入等體積過濾除菌的無水乙醇，混勻，在室溫下放置1h。
◆ 5.3.2.2 取增菌培養(yǎng)物和經(jīng)乙醇處理的增菌液分別劃線接種至卵黃瓊脂平板，35 ℃±1 ℃厭氧培養(yǎng)48h。
◆ 5.3.2.3 觀察平板培養(yǎng)物菌落形態(tài)，肉毒梭菌菌落隆起或扁平、光滑或粗糙，易成蔓延生長(zhǎng)，邊緣不規(guī)則，在菌落周圍形成乳色沉淀暈圈(E型較寬，A 型和B型較窄)，在斜視光下觀察，菌落表面呈現(xiàn)珍珠樣虹彩，這種光澤區(qū)可隨蔓延生長(zhǎng)擴(kuò)散到不規(guī)則邊緣區(qū)外的暈圈。
◆ 5.3.2.4 菌株純化培養(yǎng)，在分離培養(yǎng)平板上選擇5個(gè)肉毒梭菌可疑菌落，分別接種卵黃瓊脂平板，35℃±1℃，厭氧培養(yǎng)48h，按5.3.2.3觀察菌落形態(tài)及其純度。
梭狀芽孢桿菌在卵黃瓊脂上形態(tài)
3、鑒定實(shí)驗(yàn)
◆ 5.3.3 鑒定實(shí)驗(yàn)
◆ 5.3.3.1 染色鏡檢
挑取可疑菌落進(jìn)行涂片、革蘭氏染色和鏡檢，肉毒梭菌菌體形態(tài)為革蘭氏陽性粗大桿菌、芽胞卵圓形、大于菌體、位于次端,菌體呈網(wǎng)球拍狀。
◆ 5.3.3.2 毒素基因檢測(cè)
4、毒素基因檢測(cè)
a）菌株活化：挑取可疑菌落或待鑒定菌株接種TPGY，35℃±1℃厭氧培養(yǎng)24h。
b）DNA 模板制備：
◆ 吸取TPGY培養(yǎng)液1.4 mL至無菌離心管中，
◆ 14000×g 離心2 min，棄上清，
◆ 加入1.0 mL BS懸浮菌體，
◆ 14000×g 離心2 min，棄上清，
◆ 用400μL PBS重懸沉淀，
◆ 加入10 mg/mL 溶菌酶溶液100 μL，搖勻，37 ℃水浴15 min，
◆ 加入10 mg/mL 蛋白酶K 溶液10 μL，搖勻，60 ℃水浴1h，再沸水浴10 min，
◆ 14000×g 離心2 min，上清液轉(zhuǎn)移至無菌小離心管中，
◆ 加入3 mol/L NaAc溶液50 μL和95%乙醇1.0 mL，搖勻，-70 ℃ 或 -20 ℃ 放置30 min，
◆ 14000×g 離心10 min，棄去上清液，
◆ 沉淀干燥后溶于200 μL TE緩沖液，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
◆ 注：根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況，也可采用常規(guī)水煮沸法或商品化試劑盒制備DNA模板。
c）核酸濃度測(cè)定(必要時(shí))：
◆ 取5μLDNA 模板溶液，加超純水稀釋至1mL，
◆ 用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè) 260nm 和 280nm 波段的吸光值A(chǔ)260和A280。按式(1)計(jì)算DNA濃度。
◆ 當(dāng)濃度在0.34μg/mL—340μg/mL或A260/A280比值在1.7—1.9之間時(shí)，適宜于PCR擴(kuò)增。
C ——— DNA 濃度,單位為微克每毫升(μg/mL)；
A260 —— 260nm 處的吸光值；
N ——— 核酸稀釋倍數(shù)。
d）PCR擴(kuò)增：
1) 分別采用針對(duì)各型肉毒梭菌毒素基因設(shè)計(jì)的特異性引物(見表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，包括
● A型肉毒毒素(botulinumneurotoxinA，bont/A)、
● B型肉毒毒素(botulinumneurotoxinB，bont/B)、
● E型肉毒毒素(botulinumneurotoxinE，bont/E)、
● F型肉毒毒素(botulinumneurotoxinF，bont/F)
每個(gè)PCR反應(yīng)管檢測(cè)一種型別的肉毒梭菌。
2) 反應(yīng)體系配制見表2，反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同的反應(yīng)總體積進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。
3) 反應(yīng)程序，預(yù)變性95℃、5min；循環(huán)參數(shù)94℃、1min，60℃、1min，72℃、1min；循環(huán)數(shù)40；后延伸72℃，10min；4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
4) PCR擴(kuò)增體系應(yīng)設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。用含有已知肉毒梭菌菌株或含肉毒毒素基因的質(zhì)控品作陽性對(duì)照、非肉毒梭菌基因組DNA 作陰性對(duì)照、無菌水作空白對(duì)照。
e）凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：
◆ 用0.5×TBE緩沖液配制1.2%—1.5%的瓊脂糖凝膠，凝膠加熱融化后冷卻至60℃左右加入溴化乙錠至0.5μg/mL或Goldview5μL/100mL制備膠塊，
◆ 取10μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與2.0μL 6×加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣，其中一孔加入DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)。0.5×TBE電泳緩沖液，10V/cm 恒壓電泳。
◆ 根據(jù)溴酚藍(lán)的移動(dòng)位置確定電泳時(shí)間,用紫外檢測(cè)儀或凝膠成像系統(tǒng)觀察和記錄結(jié)果。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物也可采用毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行檢測(cè)。
f）結(jié)果判定：
◆ 陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未出現(xiàn)條帶，陽性對(duì)照出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶(見表1)，判定本次PCR檢測(cè)成立；
◆ 待測(cè)樣品出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，判定為PCR結(jié)果陽性，根據(jù)表1判定肉毒梭菌菌株型別，待測(cè)樣品未出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，判定PCR結(jié)果為陰性。
注：PCR試驗(yàn)環(huán)境條件和過程控制應(yīng)參照GB/T27403《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品分子生物學(xué)檢測(cè)》規(guī)定執(zhí)行。
肉毒梭菌 E/ F 型毒素基因PCR 檢測(cè)試劑盒（KJD07P）
? 產(chǎn)品組成：
組分名稱 | 規(guī)格×數(shù)量 |
凍干試劑 | 8 管 × 3 排 |
復(fù)溶液 | 1 mL × 1 管 |
陽性對(duì)照 | 1管(凍干型) |
陰性對(duì)照 | 1管(凍干型) |
裂解液 | 1 mL × 1 管 |
超純水 | 1 mL × 1 管 |
6 × Loading buffer | 240 μL × 1 管 |
說明書 | 1份 |
◆ 5.3.3.3 菌株產(chǎn)毒試驗(yàn)
● 將PCR陽性菌株或可疑肉毒梭菌菌株接種庖肉培養(yǎng)基或TPGYT 肉湯(用于E型肉毒梭菌)，按5.3.1.2條件厭氧培養(yǎng)5d，按5.2方法進(jìn)行毒素檢測(cè)和(或)定型試驗(yàn)，毒素確證試驗(yàn)陽性者,判定為肉毒梭菌，根據(jù)定型試驗(yàn)結(jié)果判定肉毒梭菌型別。
● 注：根據(jù)PCR陽性菌株型別，可直接用相應(yīng)型別的肉毒毒素診斷血清進(jìn)行確證試驗(yàn)。
4、毒素檢測(cè)
◆ 5.2.1毒素液制備
取樣品勻液約40mL或均勻液體樣品25mL放入離心管，3000 r/min離心10min~20min，收集上清液分為兩份放入無菌試管中，一份直接用于毒素檢測(cè)，一份用于胰酶處理后進(jìn)行毒素檢測(cè)。液體樣品保留底部沉淀及液體約12mL，重懸，制備沉淀懸浮液備用。
胰酶處理：用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)上清液pH 至6.2，按9份上清液加1份10%胰酶(活力1∶250)水溶液，混勻，37℃孵育60min，期間間或輕輕搖動(dòng)反應(yīng)液。
◆ 5.2.2檢出試驗(yàn)
用5號(hào)針頭注射器分別取離心上清液和胰酶處理上清液腹腔注射小鼠3只，每只0.5mL，觀察和記錄小鼠48h內(nèi)的中毒表現(xiàn)。典型肉毒毒素中毒癥狀多在24h內(nèi)出現(xiàn)，通常在6h內(nèi)發(fā)病和死亡，其主要表現(xiàn)為豎毛、四肢癱軟，呼吸困難，呈現(xiàn)風(fēng)箱式呼吸、腰腹部凹陷、宛如峰腰，多因呼吸衰竭而死亡，可初步判定為肉毒毒素所致。若小鼠在24h后發(fā)病或死亡，應(yīng)仔細(xì)觀察小鼠癥狀，必要時(shí)濃縮上清液重復(fù)試驗(yàn)，以排除肉毒毒素中毒。若小鼠出現(xiàn)猝死(30min內(nèi))導(dǎo)致癥狀不明顯時(shí)，應(yīng)將毒素上清液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，重復(fù)試驗(yàn)。
注：毒素檢測(cè)動(dòng)物試驗(yàn)應(yīng)遵循GB15193.2《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范》的規(guī)定。
◆ 5.2.3確證試驗(yàn)
上清液或(和)胰酶處理上清液的毒素試驗(yàn)陽性者,取相應(yīng)試驗(yàn)液3份,每份0.5mL，其中
● 第一份加等量多型混合肉毒毒素診斷血清，混勻，37℃孵育30min；
● 第二份加等量明膠磷酸鹽緩沖液,混勻后煮沸10min；
● 第三份加等量明膠磷酸鹽緩沖液，混勻。
將三份混合液分別腹腔注射小鼠各兩只，每只0.5mL，觀察96h內(nèi)小鼠的中毒和死亡情況。
結(jié)果判定：若注射第一份和第二份混合液的小鼠未死亡，而第三份混合液小鼠發(fā)病死亡，并出現(xiàn)肉毒毒素中毒的特有癥狀，則判定檢測(cè)樣品中檢出肉毒毒素。
結(jié)論 | 狀況分類 |
肉毒毒素 | 第一份和第二份未死亡，第三份死亡，并出現(xiàn)肉毒毒素中毒的特有癥狀， |
有其他易熱性毒素，也可能是肉毒毒力過強(qiáng)，需要稀釋 | 第一份死亡，第二份未死亡，第三份死亡 |
細(xì)菌性外毒素以外的毒素或毒物 | 第一份，第二份，第三份都死亡 |
無毒素，或稀釋過度 | 都未死亡 |
結(jié)果報(bào)告
◆ 6.1肉毒毒素檢測(cè)結(jié)果報(bào)告
● 根據(jù)5.2.2和5.2.3試驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告25g(mL)樣品中檢出或未檢出肉毒毒素。
● 根據(jù)5.2.5定型試驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告25g(mL)樣品中檢出某型肉毒毒素。
◆ 6.2肉毒梭菌檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告
● 根據(jù)5.3各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告樣品中檢出或未檢出肉毒梭菌或檢出某型肉毒梭菌。
