產(chǎn)品名稱：大腸埃希氏菌O157:H7核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）
英文名稱：PCR Detection Kit for Escherichia coli O157:H7(Fluorescent Probe Assays)
產(chǎn)品編號與包裝規(guī)格：
| 編號 | 規(guī)格 |
| FZ009BF2 | 48 測試/盒 |
產(chǎn)品簡介：本試劑盒適用于食品中大腸埃希氏菌O157:H7的檢測。
檢測原理：基于Real Time PCR技術(shù)，利用針對于大腸埃希氏菌O157:H7特異性基因的引物、熒光探針以及其他反應(yīng)所需試劑，加入待檢樣品即可進行擴增反應(yīng)。在發(fā)生擴增過程中，熒光探針與目的基因片段結(jié)合，可被Taq酶分解并產(chǎn)生熒光信號，此時熒光定量PCR儀可識別該熒光信號，同時根據(jù)其強弱變化繪制出相應(yīng)的實時擴增曲線，進而判定大腸埃希氏菌O157:H7是否檢出。
大腸埃希氏菌O157:H7核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)產(chǎn)品組分：
儲存條件與保質(zhì)期：-20℃避光儲存，有效期為12個月，避免反復(fù)凍融。
靈敏度：最低檢驗限達到100 CFU/Test
所需其他材料和適用儀器：熒光定量PCR儀（具有能夠檢測FAM標記的熒光通道）、高速離心機、移液器、移液槍頭及離心管等。
大腸埃希氏菌O157:H7核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)使用指南：
1，樣品前處理
1) 樣品增菌液模板 DNA 的制備：
a) 樣品增菌：參照GB 4789.36-2016《食品微生物學(xué)檢驗大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗》，取樣品25 g（mL），加入到盛有225 mL改良EC肉湯（mEC+n）的無菌容器中均質(zhì)，36±1℃培養(yǎng)18-24 h；
b) 吸增菌液1 mL到1.5 mL規(guī)格的無菌離心管中，6000 r/min離心5 min，棄上清，用50 μL無菌超純水懸浮洗滌沉淀1-2次，6000 r/min離心5 min，完全去除上清；
c) 加入30 μL裂解液，充分懸浮菌體，輕彈管壁消除氣泡，99℃加熱10 min；
d) 12000 r/min離心15 min，上清即為粗提的DNA，可轉(zhuǎn)移至0.2 mL無菌離心管中，在-20℃下可長期保存。
2) 可疑菌落模板 DNA 的制備：挑取可疑菌落，充分懸浮于預(yù)先加有30 μL裂解液的無菌離心管中，后按照上述步驟c)、d)操作。
2, 加樣、反應(yīng)
1) 按照需求取n個PCR反應(yīng)管（n=1管陰性對照+待檢測樣品數(shù)+1管陽性對照），從試劑盒中取出預(yù)混液，充分融化，渦旋后短暫離心，以上每管加入20 μL預(yù)混液，待用。
2) 向上述n個反應(yīng)管中分別加入陰性對照、待測樣品DNA、陽性對照各5 μL，蓋緊管蓋，短暫離心，立即進行PCR擴增反應(yīng)。
3) PCR反應(yīng)體系為25 μL，取FAM檢測通道，在反應(yīng)階段2中60℃時收集熒光信號，具體程序如下：
| 反應(yīng)階段 | 溫度 | 時間 | 信號收集 | 循環(huán)數(shù) |
| 1 | 95°C | 30 sec | 1 | |
| 2 | 95°C | 5 sec | } 40 | |
| 60°C | 30 sec | ? |
3, 結(jié)果：一般情況下，可通過軟件自動設(shè)定的基線、閾值等直接讀取檢測結(jié)果。如需調(diào)整，可根據(jù)所使用儀器的自身情況（如噪聲等）以及選取的不同熒光通道進行調(diào)整。
1) 質(zhì)量控制：陰性對照未出現(xiàn)明顯的S型擴增曲線或Ct值＞35，陽性對照出現(xiàn)S型擴增曲線且其Ct值＜30。若陰陽性對照不同時滿足上述條件，則本次檢測結(jié)果無效，應(yīng)重新檢測或與產(chǎn)品技術(shù)支持聯(lián)系。
2) 結(jié)果判讀：（根據(jù)反應(yīng)所得Ct值判讀，具體見下表：）
| Ct值 | 結(jié)果判讀 |
| ≤35 | 大腸埃希氏菌O157:H7陽性。 |
| 35~37 | 建議重新檢測，若結(jié)果Ct≥37，則大腸埃希氏菌O157:H7陰性，反之則為大腸埃希氏菌O157:H7陽性。 |
| ≥37 | 大腸埃希氏菌O157:H7陰性。 |
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