GB 4789.4-2024沙門氏菌檢驗標(biāo)準(zhǔn)變化解讀
發(fā)布時間：2024-08-08 瀏覽次數(shù)：1353
2024年3月，國家衛(wèi)健委、市場監(jiān)管總局聯(lián)合發(fā)布了47項食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)和6項修改單，其中包含《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗》（GB4789.4-2024）檢驗方法標(biāo)準(zhǔn)。這一新標(biāo)準(zhǔn)對實驗設(shè)備、材料和試劑、檢驗程序與操作步驟進(jìn)行了修改，并將于2024年8月8日實施。本文就該標(biāo)準(zhǔn)主要修訂內(nèi)容、操作注意事項進(jìn)行解讀。
主要變化及原因分析
變化1：在“預(yù)增菌”步驟中新增了在檢驗乳粉樣品時，須將樣品倒入225mLBPW培養(yǎng)基表面，靜置60min后再進(jìn)行預(yù)增菌。乳粉類樣品經(jīng)過高溫噴霧干燥，其中的沙門氏菌大多處于受損狀態(tài)；乳粉相對干燥且水活度低，其中受損的沙門氏菌適應(yīng)了干燥的環(huán)境。在這種情況下，如果受損的沙門氏菌在BPW中快速混勻水化，受損的沙門氏菌會出現(xiàn)滲透壓休克；采用浸泡法在室溫條件下靜置一段時間后再進(jìn)行預(yù)增菌，可以促進(jìn)受損沙門氏菌的復(fù)蘇，提高檢出率。
變化2：選擇性增菌培養(yǎng)基由氯化鎂孔雀綠大豆胨（RVS）增菌液代替亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液，并且BPW接種量改為0.1mL到10mL RVS中，選擇性增菌溫度為42℃± 1℃。SC增菌液主要適用于傷寒沙門氏菌的選擇性增菌，但通過近幾年疾病監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，我國傷寒、副傷寒沙門氏菌的發(fā)病率從10例/10萬下降到0.8例/10萬左右，而非傷寒沙門氏菌近年來發(fā)病率達(dá)到560例/10萬，在微生物引發(fā)的食源性疾病中排前2位。從培養(yǎng)基成分上看，RVS中含有孔雀綠，能夠抑制非沙門氏菌的生長，大豆蛋白胨有利于沙門氏菌的復(fù)蘇；SC增菌液配置需要的亞硒酸氫鈉具有一定毒性，在健康環(huán)保方面也存在安全風(fēng)險，且原料不穩(wěn)定，過度加熱培養(yǎng)基容易變性導(dǎo)致功能失效。
變化3：TTB四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）選擇性增菌改為：低背景菌培養(yǎng)溫度為36℃±1℃，高背景菌培養(yǎng)溫度為42℃± 1℃。經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn)，在42℃環(huán)境下，對于生鮮樣品非沙門氏菌有較好抑菌作用，比在36℃環(huán)境下的選擇性更好，所以繼續(xù)沿用；而對于深加工樣品，沙門氏菌在36℃環(huán)境下比在42℃環(huán)境下生長更好。所以低背景樣本培養(yǎng)溫度采用36℃±1℃，高背景樣本培養(yǎng)溫度采用42℃±1℃。
變化4：可以將預(yù)增菌的培養(yǎng)液、選擇性培養(yǎng)液在2~8℃保存不超過72h，再進(jìn)行后續(xù)檢驗。驗證發(fā)現(xiàn)，預(yù)增菌培養(yǎng)物、選擇性培養(yǎng)物在4℃冷藏環(huán)境下存放不超過72小時，不會影響后續(xù)檢驗。
實驗注意事項
1.樣品前處理：
樣品的正確處理與否會直接影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，新版標(biāo)準(zhǔn)中也對樣品的pH值、冷凍樣品的解凍都作了明確要求，但是在處理一些特殊樣品時還需要特別注意。
如：在檢測鮮蛋類樣品時需要將鮮蛋在流動水下洗凈，待干后用75%酒精棉消毒蛋殼，然后根據(jù)檢驗要求打開蛋殼取出蛋白、蛋黃或全蛋液，放入帶有玻璃珠的滅菌瓶內(nèi)，充分搖勻待檢；
在檢測脂肪含量超過20%的肉制品時，可根據(jù)脂肪含量加入適當(dāng)比例的滅菌吐溫-80進(jìn)行乳化混勻，也可將增菌液預(yù)熱至44℃~47℃再進(jìn)行檢測；
在檢測硬質(zhì)糖果或夾心糖果時需要使用無菌剪刀將樣品從中間剪開，漏出夾心物，并在不超過45℃的水浴中溶化15min后檢驗；
在檢測帶殼堅果類樣品時，需要用無菌剪刀（錘子）去除樣品外殼后，取可食部分進(jìn)行檢驗。
隨著《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗肉與肉制品采樣和檢驗處理》（GB 4789.17-2024）等12個相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的實施，包括沙門氏菌檢驗在內(nèi)的其他食品微生物學(xué)檢驗中樣品處理逐漸規(guī)范，這不僅要求檢驗員在實驗操作中嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行制樣，同時也要求在原始記錄中應(yīng)明確記錄樣品的制備過程。
因此，在各類現(xiàn)場審查中，食品微生物檢驗的樣品制備也會是專家老師審查重點。
2.增菌液、選擇性增菌在進(jìn)行后續(xù)接種前一定要混勻：
在新版標(biāo)準(zhǔn)中從增菌步驟開始，每一檢驗步驟均要求混勻增菌液，目的是為了能夠讓目標(biāo)培養(yǎng)物能夠均勻分布。雖然大多數(shù)沙門氏菌（除雞沙門氏菌和雞雛沙門氏菌）均有鞭毛，多數(shù)有菌毛，但是在經(jīng)過食品深加工后，沙門氏菌可能會出現(xiàn)動力丟失的現(xiàn)象，故為了防止目標(biāo)菌沉底，均要求混勻后再接種，避免漏檢發(fā)生。
3.在TTB選擇性增菌中謹(jǐn)慎選擇培養(yǎng)溫度：
新版標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了在TTB增菌中深加工食品（低背景樣本）采用36℃培養(yǎng)，生鮮食品（高背景樣品）采用42℃培養(yǎng)。但是，在實際情況中不少深加工食品生產(chǎn)企業(yè)的環(huán)境衛(wèi)生相對較差，微生物污染較為嚴(yán)重，在這種情況下單純按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方式采用36℃培養(yǎng)，就會有非目標(biāo)菌競爭沙門氏菌導(dǎo)致其無法生長，從而出現(xiàn)漏檢的情況。此外，在參加沙門氏菌能力驗證或盲樣考核時，在不清楚考核單位加菌量多少的情況下，建議在進(jìn)行TTB選擇性增菌時采用36℃、42℃兩種溫度同時培養(yǎng)，確保實驗的準(zhǔn)確性。
4.培養(yǎng)基及相關(guān)試劑的質(zhì)量控制：
新標(biāo)準(zhǔn)的附錄中將TTB的配制由原來的滅菌改為了加熱煮沸即可，但是新標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定TTB的添加劑（煌綠與碘液）要在臨用前再添加。而目前市面上銷售的即用型TTB培養(yǎng)基均提前添加了上述兩種添加劑，這與標(biāo)準(zhǔn)要求不符。因此，在標(biāo)準(zhǔn)實施后，實驗單位在使用即用型TTB時會面臨標(biāo)準(zhǔn)偏離的風(fēng)險。
血清學(xué)實驗是沙門氏菌檢測的重要步驟，雖然目前沒有標(biāo)準(zhǔn)涉及診斷血清的質(zhì)控方法，但為確保實驗準(zhǔn)確性，實驗室應(yīng)進(jìn)行診斷血清的質(zhì)量控制：O/H多價血清用同類全套抗原代表菌株進(jìn)行玻片凝集；單價血清用該單價所屬多價血清包括的其他菌株進(jìn)行玻片凝集實驗。
作者：四川省食品檢驗研究院 張建軍；
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