產(chǎn)品名稱：Easy Cloning T-vector (pEC-T)
產(chǎn)品編號與包裝規(guī)格：
| 編號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 產(chǎn)品介紹 | 價(jià)格 |
| HKT003-01A | Easy Cloning T-vector (pEC-T) | 20次 | T載體 | 540 |
| HKT003-01B | 20次×5 | 2398 |
產(chǎn)品描述：
Easy Cloning T-vector是一種PCR 產(chǎn)物高效TA克隆的專用 T載體。它由pBluescript II KS 載體改造而成：保留了pBluescript II KS 載體全部的酶切位點(diǎn)；PCR 產(chǎn)物插入位點(diǎn)處于多克隆酶 切位點(diǎn)的中間，其兩側(cè)都有眾多的酶切位點(diǎn)可供選擇。
由于本載體以 pBluescript II KS 載體為基礎(chǔ)構(gòu)建而成，所以 它具有同pBluescript II KS 載體相同的功能：PCR 產(chǎn)物插入后可 以利用α-互補(bǔ)性進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選陽性克隆?？梢杂?M13 通用引物和T7，T3 啟動子引物對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序。含有 T7 及T3RNA 聚合酶的啟動子，可以對插入片段進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。
產(chǎn)品特點(diǎn)：提供 2×快速連接系統(tǒng)（15 分鐘即可完成連接反應(yīng)）及 10× 傳統(tǒng)型連接系統(tǒng)（過 夜連接可獲得最佳連接效果），具體使用說 明見后。
使用建議：
1）連接使用的PCR片段3' 端應(yīng)帶有A末端，如果是使用Pfu等 高保真聚合酶擴(kuò)增的不帶A末端的平末端片段，不可直接用于 進(jìn)行連接反應(yīng)。
2）克隆時(shí)使用的Insert DNA片段（PCR產(chǎn)物）建議進(jìn)行切膠 回收純化，否則PCR產(chǎn)物中的短片段DNA、殘留引物等雜質(zhì)都 會影響TA克隆效率。
3）轉(zhuǎn)化過程中建議使用 Control Insert DNA 做對照，以便在實(shí) 驗(yàn)出現(xiàn)問題時(shí)確定原因。
保存溫度：-20℃
Easy Cloning T-vector (pEC-T) 產(chǎn)品包裝（A包裝）：
質(zhì)量保證：
Control Insert 克隆后的白色菌落中，有 90%以上含 有Insert DNA 片段。
Control Insert 克隆后，經(jīng)測序確認(rèn)''T''突出的存在。
操作方法：
1） 選擇合適的連接體系（詳細(xì)介紹見背面）。
2） 取10 μL 加入至 100 μL 感受態(tài)細(xì)胞中，用移 液槍吹打混合，冰上放置30 分鐘。
3） 將離心管置于 42℃水浴中，熱激 60-90 秒，迅 速將離心管置于冰上，放置 2-3 分鐘。
4） 向每個(gè)離心管中加入 500μL 無菌不含抗生素的 LB 或SOC 培養(yǎng)基中，37℃搖床，150rpm 振蕩培養(yǎng) 45 分鐘，使質(zhì)粒上氨芐抗性基因表達(dá)，菌體復(fù)蘇。
5） 吸取200μL 已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，加到含氨芐 青霉素的 LB 或SOC 固體平板上，用無菌涂布棒將細(xì) 胞均勻涂開，將平板置于 37℃培養(yǎng)箱里直至液體完全 吸收，倒置培養(yǎng) 12-16 小時(shí)。
6） PCR檢測，利用試劑盒自帶的高速PCR擴(kuò)增試 劑2×FastTaq Mast Mix直接進(jìn)行菌落PCR鑒定。
A、常規(guī)連接反應(yīng)體系（20μL）
| 組分 | 體積 |
| 10×Ligation Buffer | 2μL |
| pEC-T vector（25 ng/μL） | 2μL |
| 目的PCR 片段/ Control Insert DNA | X μL/1 μL |
| T4 DNA Ligase | 1μL |
| ddH2O | 至 20μL |
反應(yīng)條件：
1）16℃保溫 3 小時(shí)以上或過夜。 2）在4℃保溫過夜，或室溫?cái)?shù)小時(shí)，但反應(yīng)效率較16℃過夜略低。 實(shí)踐表明連接反應(yīng)的溫度越低，達(dá)到理想連接效率所需時(shí)間越長，溫度 較高則所需時(shí)間較短。
注：10×Ligation Buffer融化時(shí)，如果出現(xiàn)少量沉淀屬正?，F(xiàn)象，請 于37℃溶解混勻后使用。
B、 快速連接反應(yīng)體系：
| 組分 | 體積 |
| 2×Quick Ligation Buffer | 10μL |
| pEC-T vector（25 ng/μL） | 2μL |
| 目的PCR 片段/ Control Insert DNA | X μL/1 μL |
| T4 DNA Ligase | 1μL |
| ddH2O | 至 20μL |
反應(yīng)條件：
1）16℃ 或 25℃下，保溫15至30分鐘。
2）保溫5分鐘也能正常進(jìn)行反應(yīng)，但反應(yīng)效率略為降低。 25℃下進(jìn)行連接，其效果略差于16℃下連接效果。而更高 的溫度（>26℃）則較難形成環(huán)狀DNA。連接效率偏低時(shí)， 可適當(dāng)延長連接反應(yīng)時(shí)間，但過長的連接時(shí)間（如數(shù)小時(shí)） 連接效果反而會變差。一些較難連接的片段（如大片段）， 請采用傳統(tǒng)型10×T4 DNA Ligation Buffer體系進(jìn)行嘗試。
