無菌技術(shù)“規(guī)范”操作指南
發(fā)布時(shí)間：2025-05-26 瀏覽次數(shù)：61
為了保證實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛟跓o菌環(huán)境下順利進(jìn)行，僅僅依靠培養(yǎng)液、器械和試驗(yàn)環(huán)境等徹底消殺是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，這些都是前提條件。操作人員身上或多或少都會(huì)攜帶各種微生物，有可能再次污染環(huán)境，再加上空氣的流通性，也增加了再次污染實(shí)驗(yàn)室的可能性。
因此，為了試驗(yàn)的順利開展，最大限度地避免雜菌污染，需要我們熟練并規(guī)范地進(jìn)行無菌操作，無菌操作是試驗(yàn)成功的關(guān)鍵，必須嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，以確保實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。
一、無菌技術(shù)概念
在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作過程中，在微生物實(shí)驗(yàn)工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施。
無菌操作技術(shù)主要包括兩個(gè)方面：創(chuàng)造無菌操作環(huán)境和在操作和培養(yǎng)過程中防止一切其他微生物的侵入的措施，也就是無菌操作技術(shù)。
二、無菌操作原則
1. 區(qū)分無菌區(qū)和非無菌區(qū)，操作前戴好口罩、手套和工作服；
2. 放入超凈工作臺(tái)里的物品，必須經(jīng)過滅菌，不能擺放太擠；
3. 使用完，一定要將無關(guān)物品全部取出來，紫外照射后關(guān)閉；
4. 操作要在酒精燈旁邊操作；
5. 保證接種針冷卻后再轉(zhuǎn)移目標(biāo)菌；
6. 灼燒接種針上多余的菌種，以免污染環(huán)境。
三、無菌操作環(huán)境
指的是在使用前，無菌室或潔凈間需要消殺處理，創(chuàng)造無菌的操作環(huán)境。
1. 無菌室消毒
一般情況，在使用前，打掃衛(wèi)生，用84消毒液或新潔爾滅擦拭臺(tái)面和地面，打開紫外燈照射30min以上，使用時(shí)，關(guān)閉紫外燈，通風(fēng)10min再進(jìn)入操作。
每月用甲醛熏蒸一次，至少通風(fēng)兩天再進(jìn)入使用。
根據(jù)需要可以適當(dāng)增加消毒次數(shù)。
對(duì)于不需要潔凈間，或沒有潔凈間的實(shí)驗(yàn)室，也要定期進(jìn)行消殺。
對(duì)于大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)常污染噬菌體，需要經(jīng)常用臭氧消殺實(shí)驗(yàn)室。
無關(guān)物品不允許放入無菌室。
2. 超凈工作臺(tái)消毒
（1）使用前，用75%酒精擦拭操作臺(tái)面和四周，放入待使用物品（已經(jīng)全部滅菌），打開紫外燈照射30min。
（2）使用時(shí)，打開風(fēng)機(jī)5min后，進(jìn)入超凈工作臺(tái)操作。
（3）使用后，將無關(guān)物品全部取出，擦拭臺(tái)面，打開紫外燈照射5min，關(guān)機(jī)。
四、無菌操作技術(shù)
1. 接種針灼燒滅菌：
進(jìn)入超凈工作臺(tái)前，用75%酒精擦拭雙手，進(jìn)入超凈工作臺(tái)內(nèi)，待酒精揮發(fā)完全，點(diǎn)燃酒精燈，將接種環(huán)及金屬棒在火焰上灼燒，將接種環(huán)燒至發(fā)紅，來回灼燒金屬棒，尤其是接口處。
2. 接種針冷卻：
接種針滅菌后，移到酒精燈旁邊冷卻，備用。
3. 接種針接種：
配制好固體或液體培養(yǎng)基后，利用高壓蒸汽滅菌鍋進(jìn)行滅菌，經(jīng)過滅菌后培養(yǎng)基里無任何微生物，在超過經(jīng)工作臺(tái)內(nèi)，用接種針等將目標(biāo)菌種接種到培養(yǎng)基中的過程叫無菌操作。
簡單來說，在無菌條件下，將目標(biāo)菌種轉(zhuǎn)接到無菌培養(yǎng)基上的過程叫無菌操作。
（1）平板劃線：利用接種環(huán)將目標(biāo)菌種在固體培養(yǎng)基表面劃線，菌種逐步稀釋，培養(yǎng)后能夠長出許多單一菌落，從而達(dá)到菌種分離純化的目的。
①取菌種：取出目標(biāo)菌種，融化后，備用；
②接種針滅菌：灼燒接種針進(jìn)行滅菌；
③接種針冷卻：將接種針移至酒精燈旁邊冷卻；
④蘸取菌種： 甘油管用75%酒精消毒，待酒精揮發(fā)完全，在酒精燈火焰略微滅菌（防止烤糊），然后用接種環(huán)蘸取一環(huán)菌種；
⑤劃線：取已經(jīng)備好的固體平板，邊轉(zhuǎn)動(dòng)平板邊用酒精燈火焰滅菌，打開平板（靠口朝酒精燈），用上述接種環(huán)在平板上劃線，先在一側(cè)連續(xù)劃線3-4次，邊轉(zhuǎn)動(dòng)平板邊用酒精燈灼燒接種環(huán)，冷卻后，用接種環(huán)穿過第一次劃線部分繼續(xù)劃線3-4次，同樣方法進(jìn)行第三次劃線，或第四次劃線（根據(jù)菌液濃度和菌種類型確定劃線次數(shù)），灼燒接種環(huán)；
⑥標(biāo)記：在平板底部邊緣處標(biāo)記菌種名稱，日期和其他信息；
⑦培養(yǎng)：放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
⑧保存：待培養(yǎng)完成后保存于4℃冰箱，待用。
（2）斜面接種：從生長好的平板菌種轉(zhuǎn)接到新鮮斜面培養(yǎng)基上的接種。
①取菌種：取出目標(biāo)菌種平板；
②接種針滅菌：灼燒接種針進(jìn)行滅菌；
③接種針冷卻：將接種針移至酒精燈旁邊冷卻；
④挑取菌種：在火焰旁打開平板塞子，邊轉(zhuǎn)動(dòng)平板邊用酒精燈火焰滅菌，打開平板（靠口朝酒精燈），立即將接種環(huán)伸入平板上，挑取單菌落后蓋上平板蓋子，然后左手迅速取出新鮮試管，在火焰旁右手小指取下塞子，并灼燒試管管口，將黏有單菌落的接種環(huán)迅速放進(jìn)新鮮斜面的底部，從下至上Z字劃線，蓋上試管塞，灼燒接種環(huán)；
⑤標(biāo)記：在平板底部邊緣處標(biāo)記菌種名稱，日期和其他信息；
⑥培養(yǎng)：放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
⑦保存：待培養(yǎng)完成后保存于4℃冰箱，待用。
（3）液體接種：操作同上。
五、注意事項(xiàng)
1. 所有試驗(yàn)都必須在無菌條件下進(jìn)行，在打掃衛(wèi)生、實(shí)驗(yàn)室消毒過程中，一定要做好個(gè)人防護(hù)。
2. 試驗(yàn)過程中，一定要正確使用酒精燈，避免著火。
3. 區(qū)分滅菌物品和未滅菌物品，以免混亂，影響試驗(yàn)結(jié)果。
4. 試驗(yàn)結(jié)束一定要將無關(guān)物品從超凈工作臺(tái)中取出，該滅菌的物品一定要滅菌后再處理，避免交叉污染。
5. 采用菌落沉降法定期檢查實(shí)驗(yàn)室情況。
6. 試驗(yàn)過程中，盡量減少人員流動(dòng)。
7. 試驗(yàn)過程中，避免手部接觸試管口、三角瓶等，以免造成污染。
8. 試驗(yàn)過程中，如果出現(xiàn)意外，比如說著火，別著急，拿上濕抹布覆蓋即可。
來源：環(huán)凱轉(zhuǎn)載于“微生物知識(shí)庫”公眾號(hào)；作者~發(fā)酵菌人
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