免疫分析是一種基于抗體和抗原特異性結(jié)合的診斷工具，在醫(yī)學(xué)診斷、食品安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。然而，傳統(tǒng)免疫分析方法如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）存在一些局限性：一是需要繁瑣的兩步孵育過(guò)程，導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、試劑用量大；二是需要使用高腐蝕性的硫酸作為終止緩沖液，存在安全隱患；三是在復(fù)雜環(huán)境中單一的比色響應(yīng)可能導(dǎo)致分析結(jié)果不準(zhǔn)確和靈敏度不足。為了克服這些挑戰(zhàn)，研究者們開發(fā)了多種雙模式免疫分析方法，如比色-熒光模式、比色-電致發(fā)光模式和比色-溫度模式等，這些方法通過(guò)兩種信號(hào)輸出提高了分析性能和準(zhǔn)確性。但常用的熒光物質(zhì)如羅丹明B、量子點(diǎn)和亞甲基藍(lán)等可能對(duì)環(huán)境和人體造成長(zhǎng)期傷害，因此尋求安全環(huán)保的第二信號(hào)源變得十分迫切。
自然界的許多化合物具有自發(fā)熒光特性，且來(lái)源廣泛、成本低廉、生物相容性好、可降解，對(duì)環(huán)境和人體無(wú)害，是理想的第二信號(hào)源候選者。在免疫分析中，抗體作為核心識(shí)別元件決定了方法的特異性和靈敏度。納米抗體是一種從重鏈抗體中提取的抗體片段，具有體積小、穩(wěn)定性高、能識(shí)別隱蔽表位和成本效益高等優(yōu)點(diǎn)，可替代傳統(tǒng)抗體作為更優(yōu)的識(shí)別元件。通過(guò)基因工程，納米抗體可與其他功能材料融合形成多功能蛋白，具備多種功能如識(shí)別、催化、追蹤和偶聯(lián)等，為免疫分析提供了便捷快速的途徑。
葡萄球菌腸毒素（SEs）是金黃色葡萄球菌（S. aureus）合成的強(qiáng)效胃腸道外毒素，其中SEA是全球葡萄球菌性食物中毒的最常見原因。由于其極高的穩(wěn)定性，傳統(tǒng)的熱處理等滅菌技術(shù)對(duì)SEA的解毒或清除效果不佳。此外，傳統(tǒng)抗體因含有Fc區(qū)域，會(huì)與金黃色葡萄球菌的蛋白SpA非特異性結(jié)合，導(dǎo)致在檢測(cè)SEA時(shí)出現(xiàn)非特異性識(shí)別和假陽(yáng)性結(jié)果。因此，迫切需要一種有效且特異性強(qiáng)的SEA檢測(cè)方法，以減少對(duì)人類健康的危害。
方案1。(A) NFPs優(yōu)化示意圖，(B)特異性納米體篩選及雙功能蛋白構(gòu)建示意圖，(C) SEA檢測(cè)雙模免疫分析法示意
研究?jī)?nèi)容
圖1. 最優(yōu)NFP的選擇。
NFPs的篩選：選擇了三種 NFPs（奎寧、姜黃素和核黃素）進(jìn)行優(yōu)化，以產(chǎn)生第二信號(hào)來(lái)相互驗(yàn)證分析結(jié)果。通過(guò)測(cè)量它們與顯色底物混合后的發(fā)射光譜，并計(jì)算熒光猝滅率，發(fā)現(xiàn)奎寧的猝滅效果最佳，因此被選為雙模式免疫分析的熒光信號(hào)源。
圖2. 抗SEA特異性納米體的篩選與表征分析。
特異性納米抗體的篩選：利用噬菌體展示技術(shù)和生物淘選，經(jīng)過(guò)5輪免疫后，駱駝血清效價(jià)達(dá)到256000，證明SEA免疫刺激了駱駝體內(nèi)大量產(chǎn)生抗SEA抗體。通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)將VHH與pMECS載體連接并電穿孔轉(zhuǎn)入TG1，構(gòu)建了針對(duì)SEA的特異性噬菌體展示庫(kù)。經(jīng)過(guò)三輪生物淘選，獲得特異性陽(yáng)性克隆，并通過(guò)間接ELISA對(duì)其熱穩(wěn)定性和特異性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示納米抗體在高溫處理后仍能保持80%的結(jié)合活性，且僅對(duì)SEA產(chǎn)生信號(hào)響應(yīng)，具有優(yōu)異的特異性。
圖3. 三明治免疫分析中最佳檢測(cè)和捕獲納米體的選擇。
雙功能蛋白的構(gòu)建與表征：將檢測(cè)納米抗體SEA33與催化酶HRP融合成雙功能蛋白SEA33-vHRP。通過(guò)Phyre2預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)，顯示SEA33和HRP通過(guò)連接肽連接，分布于蛋白兩側(cè)，可獨(dú)立行使其功能。經(jīng)免疫熒光分析和SDS-PAGE分析等驗(yàn)證，SEA33-vHRP具有良好的分泌表達(dá)、純化效果以及催化活性和識(shí)別特異性。
圖4. 雙功能蛋白SEA33-vHRP的制備。
雙模式免疫分析的建立與性能評(píng)估：以SEA18為捕獲納米抗體，SEA33-vHRP為檢測(cè)納米抗體，建立了雙模式免疫分析方法。通過(guò)優(yōu)化相關(guān)參數(shù)，確定了最佳條件。在該條件下，對(duì)不同濃度的SEA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)比色模式下吸光度值隨SEA濃度增加而增加，熒光模式下因oxTMB的猝滅作用熒光強(qiáng)度隨SEA濃度增加而降低。兩種模式的標(biāo)準(zhǔn)曲線均具有良好的擬合度，比色模式和熒光模式檢測(cè)SEA的LOD分別為0.09ng/mL和0.40ng/mL，比傳統(tǒng)基于單克隆抗體的ELISA低約16倍，且通過(guò)雙模式檢測(cè)可相互驗(yàn)證測(cè)試結(jié)果，避免復(fù)雜檢測(cè)環(huán)境中分析不穩(wěn)定。
特異性與穩(wěn)定性評(píng)估：該方法對(duì)SEA有明顯響應(yīng)，而對(duì)其他干擾腸毒素?zé)o響應(yīng)，且不受金黃色葡萄球菌的干擾，具有良好的特異性和抗干擾能力。雙模式免疫分析的穩(wěn)定性研究表明，在3周的儲(chǔ)存期內(nèi)，其催化活性保持在90%以上。
圖5. 所提出的雙模免疫分析法的分析性能。
該研究意義重大，首次使用低成本、環(huán)保的大豆蛋白為主要原料，避免有毒交聯(lián)劑，成功制備出具有優(yōu)異機(jī)械性能的三維多孔SPI/CA/SA冷凍凝膠支架。不過(guò)，要實(shí)現(xiàn)SPI/CA/SA支架大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用，還需克服可擴(kuò)展性、生產(chǎn)效率、精確控制支架孔隙率和機(jī)械性能、提高細(xì)胞分化率等挑戰(zhàn)。但隨著不斷優(yōu)化和融入大規(guī)模生產(chǎn)，該支架有望推動(dòng)高效、經(jīng)濟(jì)的人造肉生產(chǎn)。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2024.142362
