產(chǎn)品名稱:pGST-TEV Expression Kit
產(chǎn)品編號(hào)與包裝規(guī)格:
編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 產(chǎn)品介紹 | 價(jià)格 |
HKV103-01A | pGST-TEV Expression Kit | 1μg/20次 | 表達(dá)載體 | 960 |
產(chǎn)品描述:
本質(zhì)粒以 Nde I 線性化方式提供,請(qǐng)配合 Plus PCR 產(chǎn) 物一步無(wú)縫克隆試劑盒使用(Cat.No. HKNR005)。GST 是實(shí)驗(yàn)室中最常用的融合標(biāo)簽之一,能夠促進(jìn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解性和正確折疊。Thormbin 作為常用的切除 GST 標(biāo)簽的蛋白酶,常常出現(xiàn)在目標(biāo)蛋白中,從而限制了其應(yīng)用。pGST-TEV 質(zhì)粒在 Thormbin 位點(diǎn)后引入了TEV 蛋白酶切點(diǎn),極大的增加了標(biāo)簽切除的特異性。
目的基因擴(kuò)增按常規(guī)方法設(shè)計(jì)引物后,在上游引物 5′端引物前添加以下序列:CTC TAC TTC CAA GGT;下游引物 5′端引物前添加:GAG TCG GAC GAA TTC。
產(chǎn)品特點(diǎn):
GST 融合標(biāo)簽?zāi)軌虼龠M(jìn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解性和正確折疊。
TEV Protease 切點(diǎn)的引入便于酶切結(jié)果的判斷和目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離。
Plus PCR 一步定向克隆試劑盒操作簡(jiǎn)便,完成質(zhì)粒構(gòu)建。
應(yīng)用實(shí)例:
保存溫度:-20℃
pGST-TEV Expression Kit 產(chǎn)品包裝(A包裝):
產(chǎn)品組成 | 體積 |
pGST-TEV(25ng/μl) | 40μl |
Plus Recombinase | 20μl |
5×Reaction Buffer | 100μl |
Control Insert(50ng/μl) | 10μl |
TEV Protease(10U/μl) | 10μl |
質(zhì)量保證:pGST-TEV 線性化載體經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的自連 測(cè)試以及連接效率測(cè)試。
注意事項(xiàng):
1)目的片段的 PCR 產(chǎn)物建議純化,避免引物二聚體等雜質(zhì)影響連接反應(yīng)。
2)目的片段與載體的摩爾比在 2:1。
3)引物設(shè)計(jì)要保證目的片段兩端有至少 15bp序列與線性化載體的兩端一致。
使用方法:
A 目的片段的獲得
目的片段通常通過(guò) PCR 獲得。引物設(shè)計(jì)要保證目的片段兩端有至少 15bp 序列與線性化載體的兩端序列一致。為保證 PCR 擴(kuò) 增的保真度,請(qǐng)盡可能選用高保真酶,推薦使用 Fast Pfu DNA聚合酶(Cat.No:HKE031)。PCR 每條引物長(zhǎng)度至少在 35-40bp,包括 5'端與載體同源的 15b 序列以及目的片段特異性 20-25bp 序列。
(注意:如果是表達(dá)載體克隆構(gòu)建,引物設(shè)計(jì)完成后,請(qǐng)注意檢 查讀碼框是否正確。)
B 目的片段與載體的重組
C 轉(zhuǎn)化(我們建議所使用的感受態(tài)細(xì)胞效率要大于 5×106 cfu/μg。轉(zhuǎn)化步驟如下:)
1,冰上融化一支感受態(tài)細(xì)胞,輕彈管壁使細(xì)胞重懸起來(lái)。加入 10μl 的反應(yīng)液到感受態(tài)細(xì)胞中,用移液 槍吹打混合,冰上放置 30 分鐘。
2,將離心管置于 42℃水浴中,熱擊 60-90 秒,迅速將離心管置于冰上,放置 2-3 分鐘。
3,向每個(gè)離心管中加入 500μl 無(wú)菌不含抗生素的LB 或 SOC 培養(yǎng)基中,37℃搖床,150rpm 振蕩培養(yǎng) 45 分鐘,使質(zhì)粒上氨芐抗性基因表達(dá),菌體復(fù)蘇。
4,吸取 200μl 已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞,加到含氨芐青霉素的 LB 或 SOC 固體平板上,用無(wú)菌涂布棒將細(xì)胞均勻涂開(kāi),將平板置于 37℃培養(yǎng)箱里直至液體完全吸收,倒置培養(yǎng) 12-16 小時(shí)。
D 陽(yáng)性克隆鑒定
PCR 檢測(cè),利用高速 PCR 擴(kuò)增試劑 2×Fast Taq Master Mix(Cat.No:HKE029)直接進(jìn)行菌落 PCR 鑒定。
鑒定引物的選擇:為避免假陽(yáng)性結(jié)果,我們建議 一條引物為載體特異性引物,另一條引物為目的片段特異性引物。
pGST 結(jié)構(gòu)圖:
Tac promoter | 184 -212 |
GSTTag | 258 -932 |
TEVsite | 933 -956 |
Amp resistance | 1380-2240 |
pBR322 Ori | 2395-3014 |
lacI CDS | 3444-4403 |
lacZ alpha | 4526-4969 |