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HKV103-01A pGST-TEV Expression Kit

英文名稱:pGST-TEV Expression Kit

貨 號(hào) :HKV103-01A

規(guī) 格 :1μg/20次

用途:表達(dá)載體

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產(chǎn)品名稱:pGST-TEV Expression Kit

產(chǎn)品編號(hào)與包裝規(guī)格:

編號(hào)產(chǎn)品名稱規(guī)格產(chǎn)品介紹價(jià)格
HKV103-01ApGST-TEV Expression Kit1μg/20次表達(dá)載體960

產(chǎn)品描述:
      本質(zhì)粒以 Nde I 線性化方式提供,請(qǐng)配合 Plus PCR 產(chǎn) 物一步無(wú)縫克隆試劑盒使用(Cat.No. HKNR005)。GST 是實(shí)驗(yàn)室中最常用的融合標(biāo)簽之一,能夠促進(jìn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解性和正確折疊。Thormbin 作為常用的切除 GST 標(biāo)簽的蛋白酶,常常出現(xiàn)在目標(biāo)蛋白中,從而限制了其應(yīng)用。pGST-TEV 質(zhì)粒在 Thormbin 位點(diǎn)后引入了TEV 蛋白酶切點(diǎn),極大的增加了標(biāo)簽切除的特異性。
      目的基因擴(kuò)增按常規(guī)方法設(shè)計(jì)引物后,在上游引物 5′端引物前添加以下序列:CTC TAC TTC CAA GGT;下游引物 5′端引物前添加:GAG TCG GAC GAA TTC。

產(chǎn)品特點(diǎn):
      GST 融合標(biāo)簽?zāi)軌虼龠M(jìn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解性和正確折疊。
      TEV Protease 切點(diǎn)的引入便于酶切結(jié)果的判斷和目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離。
      Plus PCR 一步定向克隆試劑盒操作簡(jiǎn)便,完成質(zhì)粒構(gòu)建。

應(yīng)用實(shí)例:

pGST-TEV Expression Kit應(yīng)用實(shí)例

保存溫度:-20℃

pGST-TEV Expression Kit 產(chǎn)品包裝(A包裝):

產(chǎn)品組成體積
pGST-TEV(25ng/μl)40μl
Plus Recombinase20μl
5×Reaction Buffer100μl
Control Insert(50ng/μl)10μl
TEV Protease(10U/μl)10μl

質(zhì)量保證:pGST-TEV 線性化載體經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的自連 測(cè)試以及連接效率測(cè)試。

注意事項(xiàng):
      1)目的片段的 PCR 產(chǎn)物建議純化,避免引物二聚體等雜質(zhì)影響連接反應(yīng)。
      2)目的片段與載體的摩爾比在 2:1。
      3)引物設(shè)計(jì)要保證目的片段兩端有至少 15bp序列與線性化載體的兩端一致。

使用方法:

A 目的片段的獲得
      目的片段通常通過(guò) PCR 獲得。引物設(shè)計(jì)要保證目的片段兩端有至少 15bp 序列與線性化載體的兩端序列一致。為保證 PCR 擴(kuò) 增的保真度,請(qǐng)盡可能選用高保真酶,推薦使用 Fast Pfu DNA聚合酶(Cat.No:HKE031)。PCR 每條引物長(zhǎng)度至少在 35-40bp,包括 5'端與載體同源的 15b 序列以及目的片段特異性 20-25bp 序列。
(注意:如果是表達(dá)載體克隆構(gòu)建,引物設(shè)計(jì)完成后,請(qǐng)注意檢 查讀碼框是否正確。)

B 目的片段與載體的重組

B 目的片段與載體的重組

C 轉(zhuǎn)化(我們建議所使用的感受態(tài)細(xì)胞效率要大于 5×106 cfu/μg。轉(zhuǎn)化步驟如下:)
      1,冰上融化一支感受態(tài)細(xì)胞,輕彈管壁使細(xì)胞重懸起來(lái)。加入 10μl 的反應(yīng)液到感受態(tài)細(xì)胞中,用移液 槍吹打混合,冰上放置 30 分鐘。 
      2,將離心管置于 42℃水浴中,熱擊 60-90 秒,迅速將離心管置于冰上,放置 2-3 分鐘。 
      3,向每個(gè)離心管中加入 500μl 無(wú)菌不含抗生素的LB 或 SOC 培養(yǎng)基中,37℃搖床,150rpm 振蕩培養(yǎng) 45 分鐘,使質(zhì)粒上氨芐抗性基因表達(dá),菌體復(fù)蘇。
      4,吸取 200μl 已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞,加到含氨芐青霉素的 LB 或 SOC 固體平板上,用無(wú)菌涂布棒將細(xì)胞均勻涂開(kāi),將平板置于 37℃培養(yǎng)箱里直至液體完全吸收,倒置培養(yǎng) 12-16 小時(shí)。

D 陽(yáng)性克隆鑒定
      PCR 檢測(cè),利用高速 PCR 擴(kuò)增試劑 2×Fast Taq Master Mix(Cat.No:HKE029)直接進(jìn)行菌落 PCR 鑒定。
      鑒定引物的選擇:為避免假陽(yáng)性結(jié)果,我們建議 一條引物為載體特異性引物,另一條引物為目的片段特異性引物。

pGST 結(jié)構(gòu)圖:

Tac promoter184 -212
GSTTag258 -932
TEVsite933 -956
Amp resistance1380-2240
pBR322 Ori2395-3014
lacI CDS3444-4403
lacZ alpha4526-4969

pGST 結(jié)構(gòu)圖

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